Informacija

2.3A: Gram -teigiama ląstelių sienelė - biologija


Mokymosi tikslai

  1. Po Gram dažymo procedūros nurodykite, kokios spalvos gramteigiamos bakterijos.
  2. Apibūdinkite gramteigiamų ląstelių sienelių sudėtį ir nurodykite galimas naudingas peptidoglikano, teichoic rūgščių ir paviršiaus baltymų bakterijų funkcijas.
  3. Trumpai apibūdinkite, kaip gramteigiamų ląstelių sienelių PAMP gali skatinti uždegimą.
  4. Nurodykite bakterijų adhezinų, sekrecijos sistemų ir invazinų funkciją.
  5. Nustatykite antigeną ir epitopą.

Paryškinta bakterija

  1. Perskaitykite aprašymą Enterococcusir suderinkite bakteriją su organizmo ir jo sukeltos infekcijos aprašymu.

Kaip minėta ankstesniame skyriuje apie peptidoglikaną, gramteigiamos bakterijos yra tos, kurios Gram dažymo procedūros metu išlaiko pradinę kristalinę violetinę spalvą, o stebimos per mikroskopą atrodo purpurinės. Kaip sužinosime laboratorijoje, tai yra gramteigiamų ląstelių sienelės struktūros ir funkcijos rezultatas.

Paveikslas ( PageIndex {2} ) A.1: Gramo dėmė VIolet dažyti gramteigiami kokiai ir rožinės spalvos gramneigiamos lazdelės formos bakterijos. iš Vikipedijos (Y tambe).

Norėdami gauti daugiau informacijos: „Gram“ dėmės peržiūra iš 6 laboratorijos.

„Flash“ animacija, iliustruojanti „Gram“ dėmių reagentų sąveiką molekuliniu lygiu
© Daniel Cavanaugh, Mark Keen, autoriai, Licencijuota naudoti, ASM MicrobeLibrary.

Įprastos medicininės svarbos gramteigiamos bakterijos yra Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, ir Clostridium rūšis.

Paryškinta bakterija: Enterococcus rūšis

Spustelėkite šią nuorodą ir perskaitykite aprašymą Enterococcusir sugebėti suderinti bakteriją su jos aprašymu per egzaminą.

Gramteigiamų ląstelių sienelių struktūra ir sudėtis

1. Elektronų mikrografijose gramteigiama ląstelių sienelė atrodo kaip plati, tanki siena, kurios storis 20-80 nm ir kurią sudaro daugybė tarpusavyje sujungtų peptidoglikano sluoksnių (žr. 1A ir 1B pav.). Chemiškai 60–90% gramteigiamų ląstelių sienelių yra peptidoglikanas. Gramteigiamose bakterijose manoma, kad peptidoglikanas yra išdėstytas kabeliuose, susidedančiuose iš maždaug 50 nm pločio susietų glikano gijų. Tada šie kabeliai tampa susieti, kad būtų užtikrintas didesnis ląstelių sienelių stiprumas.

2. Gramteigiamų ląstelių sienelėje susipynusios teichoinės rūgštys ir lipoteichoinės rūgštys. Teichoinės rūgštys tęsiasi per likusį ląstelių sienelę ir už jos ribų ir yra polialkoholiai, sudaryti iš glicerolio, fosfatų ir cukraus alkoholio ribitolio polimerų ir yra kovalentiškai susieti su peptidoglikanu. Teichoinės rūgštys, kovalentiškai susietos su citoplazminės membranos lipidais, vadinamos lipoteiko rūgštimis (žr. Paveikslėlį ( PageIndex {1} ) B).

3. Išorinis peptidoglikano paviršius yra padengtas paviršiniais baltymais, kurie skiriasi nuo bakterijos kamieno ir rūšies (žr. Paveikslėlį ( PageIndex {1} ) B).

4. Periplazma yra želatinė medžiaga tarp peptidoglikano ir citoplazmos membranos.

Norėdami peržiūrėti elektronų mikrografą Streptokokas rodanti gramteigiamą ląstelių sienelę, žr. Rokfelerio universiteto tinklalapį.

Gramteigiamų ląstelių sienelių komponentų funkcijos

1. Gramteigiamų ląstelių sienelėje esantis peptidoglikanas apsaugo nuo osmosinės lizės.

2. Teichoinės rūgštys tikriausiai padeda sustiprinti ląstelių sienelę (žr. Paveikslėlį ( PageIndex {1} ) B).

3. Paviršiniai baltymai (žr. Paveikslėlį ( PageIndex {1} ) B) bakterijų peptidoglikane, priklausomai nuo padermės ir rūšies, atlieka įvairią veiklą.

a. Kai kurie paviršiniai baltymai veikia kaip fermentai.

b. Kiti baltymai tarnauja kaip adhezinai. Adhezinai leidžia bakterijai glaudžiai prilipti prie skambučių ir kitų paviršių, kad galėtų kolonizuoti šias ląsteles ir atsispirti paraudimui (žr. Paveikslėlį ( PageIndex {2} )).

c. Daugelis bakterijų, dalyvaujančių infekcijoje, turi galimybę kartu pasirinkti šeimininko ląstelių funkcijas, kad jos pačios naudai. Tai daroma naudojant bakterijų sekrecijos sistemas, kurios leidžia bakterijai tiesiogiai įšvirkšti bakterijų efektorines molekules į ląstelės šeimininkės citoplazmą, kad būtų pakeista jos ląstelinė mašina ar ląstelių ryšys bakterijų naudai. Jie tai daro gamindami sekrecijos sistemas, tokias kaip 3 tipo sekrecijos sistema, gaminanti tuščiavidurius, į adatą panašius mėgintuvėlius, vadinamus injekcinėmis. Pavyzdžiui, tam tikros bakterijos švirkščia invaziną į ląstelės šeimininkės citoplazmą, leidžiančią bakterijai patekti į tą ląstelę.

Šių ląstelių sienelių paviršiaus baltymų vaidmuo bus išsamiau aptartas vėliau 3 skyriuje, skyriuje „Bakterinis patogeniškumas“.

4. Periplazmoje yra fermentų maistinėms medžiagoms skaidyti.

Gramteigiamų ląstelių sienelių komponentų reikšmė organizmo gynybai inicijuoti

Kūnas turi dvi imunines sistemas: įgimtą imuninę sistemą ir prisitaikančią imuninę sistemą.

1. Įgimtas imunitetas yra antigenui nespecifiniai gynybos mechanizmai, kuriuos šeimininkas naudoja iš karto arba per kelias valandas po sąlyčio su beveik bet kokiu mikrobu. Tai imunitetas, su kuriuo gimsta, ir tai yra pirminis organizmo atsakas, siekiant pašalinti mikrobus ir užkirsti kelią infekcijai.

2. Adaptyvusis (įgytas) imunitetas reiškia specifinius antigeno gynybos mechanizmus, kurie užtrunka keletą dienų, kad taptų apsauginiai ir skirti reaguoti su konkrečiu antigenu ir jį pašalinti. Tai imunitetas, kuris vystosi visą gyvenimą.

Įgimto imuniteto pradžia

Norėdami apsisaugoti nuo infekcijos, vienas iš dalykų, kuriuos organizmas iš pradžių turi padaryti, yra nustatyti mikroorganizmų buvimą. Kūnas tai daro atpažindamas molekules, būdingas tik mikroorganizmams, kurie nėra susiję su žmogaus ląstelėmis. Šios unikalios molekulės vadinamos su patogenais susijusiais molekuliniais modeliais arba PAMP. (Kadangi visi mikrobai, ne tik patogeniniai mikrobai, turi PAMP, su patogenu susiję molekuliniai modeliai kartais vadinami su mikrobais susijusiais molekuliniais modeliais arba MAMP.)

Peptidoglikano ir teiko rūgščių fragmentai yra PAMPS, susiję su gramteigiamų bakterijų ląstelių sienelėmis. Be to, bakterijos ir kiti mikroorganizmai taip pat turi daug manozės turinčių glikanų (trumpų angliavandenių grandinių, kurių galutinis cukrus yra cukraus manozė arba fruktozė), kurios veikia kaip PAMP. Šie glikanai, kuriuose gausu manozės, yra paplitę mikrobų glikoproteinuose ir glikolipiduose, tačiau retai pasitaiko žmonėms (žr. Paveikslėlį ( PageIndex {3} )).

Šie PAMPS jungiasi prie modelio atpažinimo receptorių arba PRR įvairiose organizmo gynybinėse ląstelėse ir sukelia tokias įgimtas imunines gynybas kaip uždegimas, karščiavimas ir fagocitozė.

Uždegimas yra pirmasis atsakas į infekciją ir sužalojimą ir yra labai svarbus kūno gynybai. Iš esmės uždegiminis atsakas yra kūno bandymas atkurti ir palaikyti homeostazę po traumos. Dauguma kūno gynybos elementų yra kraujyje, o uždegimas yra priemonė, kuria kūno gynybos ląstelės ir kūno gynybos cheminės medžiagos palieka kraują ir patenka į audinius aplink sužeistą ar užkrėstą vietą.

Kūno gynybos ląstelės, tokios kaip makrofagai ir dendritinės ląstelės, turi modelio atpažinimo receptorius, tokius kaip į rinkliavą panašūs receptoriai, kurie yra specifiniai peptidoglikano fragmentams ir lipoteichoinėms rūgštims, esančioms gramteigiamoje ląstelių sienelėje, ir (arba) jų citoplazmoje esantiems NOD. būdingas peptidoglikano fragmentams.

Šių ląstelių sienelių komponentų prisijungimas prie atitinkamų modelio atpažinimo receptorių skatina makrofagus išskirti įvairias gynybos reguliavimo chemines medžiagas, vadinamas citokinais, įskaitant IL-1, IL-6, IL-8, TNF-alfa ir PAF. Tada citokinai prisijungia prie tikslinių ląstelių citokinų receptorių ir inicijuoja uždegimą bei aktyvina tiek komplemento kelius, tiek krešėjimo kelią (žr. Paveikslėlį ( PageIndex {4} )).

Peptidoglikanas ir teiko rūgštys taip pat aktyvina alternatyvų komplemento kelią ir lektino kelią, įgimtus imuninės gynybos kelius, kurie atlieka įvairius kūno gynybos vaidmenis.

Įgimtas imunitetas bus išsamiau aptartas 5 skyriuje.

Adaptyvaus imuniteto pradžia

Baltymai ir polisacharidai, susiję su gramteigiamomis ląstelių sienelėmis, veikia kaip antigenai ir inicijuoja adaptacinį imunitetą. Antigenas apibrėžiamas kaip molekulinė forma, reaguojanti su antikūnų molekulėmis ir su limfocitų antigeno receptoriais. Mes pripažįstame tas molekulines formas kaip svetimas arba skiriasi nuo mūsų kūno molekulinių formų, nes jos tinka specifiniams antigeno receptoriams mūsų B-limfocituose ir T-limfocituose-ląstelėse, kurios atlieka adaptacinį imunitetą.

Tikrosios antigeno dalys ar fragmentai, reaguojantys su antikūnais ir su B-limfocitų bei T-limfocitų receptoriais, vadinami epitopais. Paprastai epitopas yra 5-15 aminorūgščių grupė, turinti unikalią formą, sudaranti baltymo antigeno dalį arba 3-4 cukraus likučius, išsišakojusius iš polisacharidinio antigeno. Viename mikroorganizme yra daug šimtų skirtingų formų epitopų, kuriuos mūsų limfocitai gali atpažinti kaip svetimus ir sukuria adaptacinį imuninį atsaką.

Kūnas atpažįsta antigeną kaip svetimą, kai to antigeno epitopai prisijungia prie B-limfocitų ir T-limfocitų, naudodami epitopui būdingas receptorių molekules, kurios formos papildo epitopo formą. B limfocitų paviršiuje esantis epitopo receptorius vadinamas B ląstelių receptoriumi ir iš tikrųjų yra antikūno molekulė. T-limfocitų receptorius vadinamas T-ląstelių receptoriumi (TCR).

Yra dvi pagrindinės adaptyvaus imuninio atsako šakos: humoralinis imunitetas ir ląstelių sukeltas imunitetas.

1. Humoralinis imunitetas: Humoralinis imunitetas apima antikūnų molekulių gamybą reaguojant į antigeną ir yra tarpininkaujamas B-limfocitų. Įvairiais mechanizmais šie antikūnai sugeba pašalinti arba neutralizuoti mikroorganizmus ir jų toksinus, prisijungę prie jų epitopų. Pavyzdžiui, antikūnai, pagaminti prieš ląstelių sienelių antigenus, gali prilipti bakterijas prie fagocitų, o tai vadinama opsonizacija. Antikūnai, pagaminti prieš ląstelių sienelių adhezinus, gali užkirsti kelią bakterijoms prilipti ir kolonizuoti šeimininko ląsteles.

2. Ląstelių sukeltas imunitetas. Ląstelių sukeliamas imunitetas apima citotoksinių T-limfocitų, aktyvuotų makrofagų, aktyvuotų NK ląstelių ir citokinų gamybą, reaguojant į antigeną, ir tarpininkauja T-limfocitai. Šios gynybinės ląstelės padeda pašalinti užkrėstas ląsteles ir vėžines ląsteles, rodančias svetimus epitopus.

Prisitaikantis imunitetas bus išsamiau aptartas 6 skyriuje.

Gramteigiamų ląstelių sienelių komponentų reikšmė bakterijų patogeniškumui

Tačiau esant sunkioms sisteminėms infekcijoms, kuriose yra daug bakterijų, išsiskiria didelis kiekis gramteigiamų PAMP, todėl makrofagai ir kitos ląstelės gamina per daug citokinų, o tai savo ruožtu gali pakenkti organizmui (žr. {5} )).

Santrauka

  1. Dėl jų ląstelių sienelės pobūdžio gramteigiamos bakterijos po Gramo dažymo nusidažo purpurine spalva.
  2. Gramteigiamą ląstelių sienelę sudaro daugybė tarpusavyje sujungtų peptidoglikano sluoksnių ir trūksta išorinės membranos.
  3. Peptidoglikanas apsaugo nuo osmosinės lizės hipotoninėje aplinkoje, kurioje gyvena dauguma bakterijų.
  4. Teichoinės ir lipoteichoinės rūgštys yra susipynusios per peptidoglikano sluoksnius.
  5. Paviršiniai baltymai, įterpti į ląstelės sienelę, gali veikti kaip adhezinai, sekrecijos sistemos ir fermentai.
  6. Gramteigiama ląstelių sienelė suaktyvina įgimtą organizmo imuninę apsaugą ir prisitaikančią imuninę apsaugą.
  7. Kūnas suaktyvina įgimtą imunitetą, atpažindamas molekules, būdingas tik mikroorganizmams, nesusijusiems su žmogaus ląstelėmis, vadinamomis su patogenais susijusiais molekuliniais modeliais arba PAMP. PAMP jungiasi prie gynybos ląstelių modelio atpažinimo receptorių (PRR), kad paskatintų uždegiminių citokinų gamybą.
  8. Uždegimas yra priemonė, kuria organizmas pristato gynybos ląsteles ir gynybos molekules į infekcijos vietą, tačiau per didelis uždegimas gali būti žalingas ir netgi mirtinas organizmui.
  9. PAMP, siejami su gramteigiama ląstelių sienele, apima peptidoglikano monomerus, teichoines rūgštis, lipoteichoines rūgštis ir manozės turinčias cukraus grandines.
  10. Antigenas yra molekulinė forma, kuri reaguoja su limfocitų antigeno receptoriais ir pradeda adaptacinį imuninį atsaką.
  11. Ląstelių sienelės molekulės taip pat gali sukelti adaptacinį imunitetą, pavyzdžiui, gaminti antikūnų molekules prieš bakterijų ląstelių sienelių antigenus.

Klausimai

Išstudijuokite šio skyriaus medžiagą ir parašykite atsakymus į šiuos klausimus. Negalima tiesiog spustelėti atsakymų ir juos parašyti. Tai nepatikrins jūsų supratimo apie šią mokymo programą.

  1. Nurodykite, kokios spalvos gramteigiamos bakterijos atsiranda po Gram dažymo procedūros. (ans)
  2. Apibūdinkite gramteigiamų ląstelių sienelių struktūrą ir išvaizdą. (ans)
  3. Nurodykite šių gramteigiamų ląstelių sienelių komponentų naudingą bakterijos funkciją:
    1. peptidoglikanas (ans)
    2. teicho rūgštys (ans)
    3. adhezinai (ans)
    4. invazinai (ans)
  4. Trumpai apibūdinkite, kaip gramteigiamų ląstelių sienelių PAMP gali skatinti uždegimą. (ans)
  5. Apibrėžkite antigeną. (ans)

Gram-teigiamas ir gramneigiamas

„Gramteigiamas“ ir „gramneigiamas“ yra terminai, naudojami plačiai suskirstyti dvi skirtingas bakterijų rūšis. Šis skirtumas yra pagrįstas jų ląstelių sienelių struktūra ir jų reakcija į Gramo dažymą.

Gramteigiamų bakterijų ląstelių sienelės yra pagamintos iš storo peptidoglikano sluoksnio. Gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelėse yra tik plonas peptidoglikano sluoksnis, tačiau jos taip pat turi išorinę membraną, kurios nėra gramteigiamose bakterijose.

Gramo dažymas yra metodas, kuriame naudojami violetiniai dažai, skirti atskirti gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas. Jei bakterijos yra gramteigiamos, storas peptidoglikano sluoksnis jų ląstelių sienelėse sulaiko dažus ir jie nusidažo violetine spalva. Jei bakterijos yra gramneigiamos, dažai ištekės iš plono peptidoglikano sluoksnio, o bakterijos nusidažys raudonai.


Skirtumas tarp gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelių

Daugumą bakterijų ląstelių supa stora standi ląstelių sienelė. Ląstelės sienelė suteikia ląstelės formą ir apsaugo bakterijas nuo osmosinio slėgio pokyčių. Peptidoglikanas (mureinas) yra pagrindinis bakterijų ląstelių sienelės komponentas ir yra atsakingas už ląstelių sienelės formą ir ypatingai kietą pobūdį.

Atsižvelgiant į ląstelių sienelės savybes, bakterijų ląstelės yra suskirstytos į Gram teigiamas ir gramneigiamas, pirmiausia remiantis klasikine dažymo reakcija, vadinama „Gram Staining“. Ankstesniame įraše mes aptarėme apie Gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų panašumai ir skirtumai. Tiek gramteigiamos, tiek gramneigiamos bakterijos turi ląstelių sienelę, tačiau jų struktūrinė struktūra, cheminės ir fizinės savybės skiriasi. Apskritai, gramteigiamų bakterijų ląstelių sienelės turi paprastesnes chemines struktūras, palyginti su gramneigiamomis bakterijomis.

Šiame įraše aptariami gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelių skirtumai su palyginimo lentele.

Gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelių palyginimas
Skirtumas tarp gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelių


Gramteigiamos ląstelių sienos:

Gramteigiamų bakterijų ląstelių sieneles daugiausia sudaro peptidoglikanas. Tiesą sakant, peptidoglikanas gali perduoti iki 90% ląstelės sienelės, o sluoksnis po sluoksnio aplink ląstelės membraną. NAM tetrapeptidai paprastai yra susieti su peptidų tarpiniu tiltu, ir visiškas kryžminis ryšys yra įprastas. Visa tai sujungia ir sukuria neįtikėtinai stiprią ląstelių sienelę.

Vaizdo kreditas: www.open.oregnostate.education

Papildomas komponentas gramteigiamoje ląstelių sienelėje yra teicho rūgštis, glikopolimeras glicerolis arba ribitolis sujungtos fosfatų grupėmis, kurios yra įterptos į peptidoglikano sluoksnius. Teichoinės rūgštys gali būti kovalentiškai sujungtos su peptidoglikanu (sienelės teichoinės rūgštys arba WTA) arba prijungtos prie ląstelės membranos per lipidų inkarą, o šiuo atveju ji paminėta kaip lipoteiko rūgštis. Manoma, kad teicho rūgštis atlieka įvairius svarbius ląstelės vaidmenis, pavyzdžiui, ląstelės interneto įkrovimą, kuris yra svarbus protonų varomosios jėgos vystymuisi. Teichoinė rūgštis prisideda prie bendro ląstelių membranos standumo, kuris yra gyvybiškai svarbus palaikant ląstelių formą, ypač lazdelės formos organizmuose. Taip pat yra įrodymų, kad teichoinės rūgštys dalyvauja ląstelių dalijime, sąveikaudamos su peptidoglikano biosintezės mašina. Galiausiai, atrodo, kad teichoinės rūgštys yra atsparios nepalankioms sąlygoms, tokioms kaip aukšta temperatūra ir didelė druskos koncentracija, taip pat naudojant β-laktaminius antibiotikus. Be to, kai kurios teiko rūgštys gali būti susijusios su patogeninių rūšių prijungimu prie šeimininko audinių, taip inicijuojant infekcinės ligos procesą.

Periplazminė erdvė yra tarp plazmos membranos ir ląstelės sienelės ir yra tokia siaura, kad dažnai nėra matoma. Periplazmoje yra palyginti nedaug baltymų, nes peptidoglikano sacculus yra akytas ir daugelis baltymų, perkeliamų per plazmos membraną, praeina per sacculus. Kai kurie išskiriami baltymai yra fermentai, vadinami egzoenzimais. Šie tarpląsteliniai fermentai susidaro ląstelės citoplazmoje, o po to išskiriami pro ląstelės membraną per ląstelės sienelę, kur jie veikia už ląstelės ribų ir suskaido dideles makromolekules į mažesnius komponentus.

Be to, į polimerus, įterptus į peptidoglikano sacculus, dažnai yra baltymų, susijusių su jo paviršiumi. Šie baltymai dalyvauja ląstelės sąveikoje su aplinka. Kai kurie yra nekovalentiškai tikri dėl teichoinių rūgščių ar kitų ląstelių sienelių polimerų. Kiti paviršiniai baltymai yra kovalentiškai susieti su peptidoglikanu. Membranos surišti fermentai, vadinami sortazėmis, katalizuoja kovalentinių ryšių, kurie prideda šiuos baltymus kartu su peptidoglikanu, susidarymą. Daugelis kovalentiškai susietų baltymų atlieka virulentiškumo vaidmenį. Pavyzdžiui, patogeninių streptokokų M baltymas padeda sukibti su šeimininko audiniais ir trukdo šeimininko gynybai.


Bakterijų ląstelių sienelės: apžvalga

Vien tik prokariotinės ląstelės membranos nepakanka, kad būtų užtikrintas standumas, kurio reikia laisvai gyvenančiam organizmui. Gramteigiamose bakterijose ląstelės formą ir vientisumą palaiko storas vienas sluoksnis peptidoglikanas. Tačiau gramneigiama ląstelių sienelė tapo sudėtingesnė, o antroji membrana yra už ląstelės membranos, sudarydama periplazmą, kurioje atsiranda chemiškai panašus, bet plonesnis peptidoglikano sluoksnis. Išorinę membraną daugiausia sudaro lipopolisacharidas (LPS). Tiek gramneigiamose, tiek gramteigiamose ląstelių sienelėse yra daug baltymų, kurie prasiskverbia pro jų paviršius arba yra pritvirtinti prie jų. Kai kurie iš jų padeda aptikti aplinkos signalus.

Augimo substratai, metabolitai ir išskiriami baltymai taip pat leidžiami praeiti per storą išorinį sluoksnį per specifinius baltymų prievadus. Pagrindiniai gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelių skirtumai pateikti lentelėje

▶ Peptidoglikanas

Peptidoglikanas arba mureinas susideda iš dviejų cukraus darinių, Nacetilglukozaminas (NAG) ir Nacetilmuramas rūgštis (NAM) su β (1–4) jungtimi. Kintamos NAM ir NAG grandinės yra susietos aminorūgščių, tokių kaip l-alaninas ir d-glutamo rūgštis, taip pat diaminopimelio rūgštis (DAP). Kryžminių jungčių susidarymo būdas skiriasi gramneigiamomis ir gramteigiamomis bakterijomis. Daugumoje gramneigiamų bakterijų yra tiesioginis tarpinis tiltas tarp polipeptido šoninių grandinių, kylančių iš gretimų NAG/NAM polimerų, o daugumoje gramteigiamų bakterijų šonines grandines jungiantis tiltas yra glicino pentapeptidas. Peptidoglikano struktūra yra labai išsaugota tarp visų bakterijų, vieninteliai variantai yra nedideli tarpinio tilto pokyčiai. Peptidoglikanas yra atsparus daugeliui cheminių medžiagų, tačiau lengvai suskaidomas lizocimas, kuris nutraukia ryšius tarp NAG ir NAM. Be suvaržančio polimero, osmosinis potencialas yra per didelis, kad ląstelės membrana galėtų joje būti ir ląstelė sprogsta. Lizocimo yra daugelyje žmogaus kūno išskyrų, kaip pirmoji gynybos nuo bakterijų invazijos forma. Tos ląstelės be peptidoglikano (ypač mikoplazmos) vengia šios lizės.

Gramteigiamos bakterijos turi medžiagų, vadinamų teichoic ir teichurono rūgštys susikerta su peptidoglikano polimeru. „Teichoic“ yra platus terminas, apimantis polimerus, kurių sudėtyje yra glicerofosfato arba ribitolio fosfato, ir atrodo, kad šių junginių pagrindinė funkcija yra surišti esminius dvivalenčius katijonus, tokius kaip Mg 2+, išlaikant vietinę ląstelės joninę aplinką. Bendras teichoinių rūgščių buvimo membranoje poveikis yra tas, kad ląstelė gauna šiek tiek neigiamą krūvį.

Labai sunku apibendrinti Archeal ląstelių sienelių struktūrą, nes įvairovė yra daug didesnė nei bakterijų. Nors mūsų žinios apie archealinių ląstelių sieną nėra tokios išsivysčiusios kaip bakterijų, mes žinome, kad kai kurios archajos turi junginį, labai panašų į mureiną, pavadintą pseudopeptidoglikanas. Tai turi stuburą, kuriame yra NAG, tačiau kintamasis NAM pakeičiamas N-acetiltalosaminurono rūgštimi ir yra β (1–3), o ne β (1–4). Tačiau daugelis archejų išlaiko standumą, naudodami polisacharido, baltymų ir glikoproteinų mišinį.

▶ Gramo dėmė

Pagrindinis skirtumas tarp dviejų pagrindinių bakterijų grupių išlieka gramo dėmė. Gramteigiamas ir gramneigiamas naudojamas identifikavimui, klasifikavimui ir taksonomijai iškart po morfologinio tyrimo. Šis svarbus metodas grindžiamas ląstelės sienelės gebėjimu išlaikyti arba prarasti tam tikras chemines medžiagas. Dažymo procedūrą 1884 m. Sukūrė Christianas Gramas. Nuo to laiko jis pasirodė esąs biocheminis ir tada filogenetinis bakterijų reikšmė. Pirmiausia ląstelės pritvirtinamos prie stiklo mikroskopo stiklelio (paprastai švelniai kaitinant virš Bunseno liepsnos) ir krištolo violetinė naudojamas preparato dažymui. Siekiant kristalinės violetinės spalvos derinti su ląstelės sienele, tirpalas jodo tada pridedama. Jei skaidrė dabar plaunama alkoholio, surišta krištolo violetinė dėmė bus išplauta iš plonasienių gramneigiamų ląstelių, bet negali praeiti pro storesnę gramteigiamą sieną.

Kontrastas nuo karbolis fuksinas tada nudažo visas gramneigiamas ląsteles šviesiai rausva spalva, o gramteigiamos ląstelės išlaiko giliai violetinę spalvą. Šiuos spalvų skirtumus galima aiškiai matyti šviesos mikroskopu. Dauguma bakterijų su šia dėme reaguoja į savo filogeniją, tik kelios rūšys, tokios kaip Paracoccus, elgiasi neįprastai. Buvo bandoma klasifikuoti Archaea su Gramo dėme, bet, deja, šioje karalystėje dažymo kintamumas prasideda nuo porūšio lygio.

▶ Gramneigiama išorinė membrana

Priešingai nei gramteigiamos bakterijos, Bacterium E. coli modelis nepateikia peptidoglikano sluoksnio išoriniam pasauliui. Vietoj to mureinas yra suspenduotas periplazminėje erdvėje ir yra antra išorinė LPS membrana. Gramneigiama išorinė membrana turi tam tikrų bendrų savybių su citoplazmos membrana, nes ji yra dvisluoksnis lipidų sluoksnis ir yra laikoma skysta mozaika. Tačiau ne tik fosfolipidai, bet ir daug lipidų su polisacharidu. Tai keičia chemines ir fizines membranos savybes, nes ji yra daug akytesnė daug didesnėms molekulėms. Šią poringumą sustiprina daugelio buvimas porinas ir transportuoja baltymus.

Išorinę gramneigiamų bakterijų membranos struktūrą lėmė antigeninės LPS savybės, todėl detalės, neva vaizduojančios gramneigiamus, iš tikrųjų yra svarbesnės patogeninėms žarnyno bakterijoms, tokioms kaip E. coli, Salmonella ir kt. LPS buvimas gali išprovokuoti stiprų imuninį atsaką žinduoliams, todėl tokiose gentyse, kaip Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria ir Haemophilus, terminas LPS tapo keičiamas su „endotoksinasŠios išorinės LPS membranos chemija yra sudėtinga ir įvairi. Salmonelėse lipidinė molekulės dalis (lipidai A.) yra fosforilintas gliukozaminas, susietas su ilgomis anglies grandinėmis, kurios, priešingai nei membraniniai lipidai, gali būti šakotos. Gramneigiamų bakterijų lipidai A yra kovalentiškai susiję su šerdies polisacharidas tačiau net jei ji yra atskirta nuo likusios molekulės, ji dažnai yra toksiška žinduoliams, net jei kilmės bakterija nėra patogeniška. Lipidas A padeda pritvirtinti LPS prie likusios išorinės membranos.

Pagrindinis polisacharidas (arba R antigenas arba R polisacharidas) yra vienodas visuose tam tikros genties nariuose ir yra sudarytas iš heptozės ir heksozės cukrų bei ketodeoksioktonato (KDO). Galiausiai, O antigenas (arba somatinį antigeną arba O polisacharidą) sudaro nuo trijų iki penkių pasikartojančių cukrų. Kartojimo sudėtis įvairiose rūšyse skiriasi ir gali būti kartojama nuo 1 iki 40 kartų. Tai yra pagrindinis antigeninis patogeninių ląstelių veiksnys.


Gram neigiama ląstelių sienelė:

Gramneigiamos bakterijos turi plonesnį peptidoglikano sluoksnį (10% ląstelės sienelės) ir praranda kristalinio violetinio jodo kompleksą, pašalindamos spalvą alkoholio skalavimo tirpalu, tačiau išlaiko priešingą dėmę Safranin, todėl atrodo rausvos arba rausvos spalvos. Jie taip pat turi papildomą išorinę membraną, kurioje yra lipidų, kuri yra atskirta nuo ląstelės sienelės perplazminės erdvės pagalba.

Medicininė gramneigiamų ląstelių sienelių reikšmė:

Gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelės dažnai yra virulentiškumo veiksnys, leidžiantis patogeninėms bakterijoms sukelti ligas. Gramneigiamų bakterijų virulentiškumas dažnai siejamas su tam tikrais ląstelės sienelės komponentais, ypač su lipopolisacharidu (kitaip LPS arba endotoksinu). Žmonėms LPS sukelia įgimtą imuninį atsaką, kuriam būdinga citokinų gamyba ir imuninės sistemos aktyvinimas. Uždegimas atsiranda dėl citokinų gamybos, kuri taip pat gali sukelti toksiškumą šeimininkui.


Gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelių sudėtis

Ląstelės sienelė sudaro gana standų sluoksnį, esantį už plazmos membranos ribų daugumoje prokariotų. Ląstelės sienelė sudaro nuo 10 iki 40 % ląstelių sausos masės, priklausomai nuo augimo sąlygų. Tai užtikrina ląstelių palaikymą ir apsaugą nuo mechaninio įtempio ar pažeidimų osmosinis plyšimas ir lizė. Pagrindinis bakterijų ląstelių sienelės komponentas yra peptidoglikanas arba mureinas. Ši standi peplidoglikano struktūra, būdinga tik prokariotams. suteikia ląstelės formą ir supa citoplazminę membraną.

Bendra ląstelės sienelės struktūra

1]. Šviesos mikroskopinis bakterijų tyrimas neleidžia pastebėti gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelių skirtumų. Tai įmanoma tik tada, kai ląstelių sienos tiriamos transmisijos elektroniniu mikroskopu.

2]. Siena gramteigiamos bakterijos susideda iš vieno homogeniško mureino peptidoglikano sluoksnio). kurie lieka už plazmos membranos ribų. Jis yra nuo 20 iki 80 nm storio.

3]. Ląstelės siena gramneigiamos bakterijos susideda iš vieno sluoksnio išorinė membrana (7–8 nm storio) ir vienas sluoksnis peptidoglikanas (Nuo 2 iki 7 nm storio)

4]. Tarp plazmos membranos ir ląstelės sienelės išorinės membranos pastebimas tarpas. Tai vadinama periplazma. Gramneigiamų bakterijų periplazmoje yra hidrolizuojančių fermentų. Jie palengvina molekulių judėjimą per membraną.

5]. Gramteigiamų bakterijų ląstelių sienelėje pagrindinės sudedamosios dalys yra peptidoglikanas ir telcholio rūgštis, o gramneigiamose bakterijose - peptidoglikanas. lipopolisacharidas, lipoproteinai ir fosfolipidai.

1]. Peptidoglikanas (dar vadinamas mureinas ) yra svarbiausia prokariotinių ląstelių sienelės sudedamoji dalis. Jis yra gana akytas, elastingas ir šiek tiek ištemptas. Tai sudėtingas į tinklą panašus kartotinių subvienetų polimeras. Cheminė sudėtis ir struktūra skiriasi nuo rūšies iki rūšies. Tačiau pagrindinė struktūra yra ta pati

2]. Peptidoglikanas. hetero-polisacharidas susideda iš pasikartojančių disacharidų vienetų, prie kurių prisijungia trumpa peptidų grandinė ir sudaro sudėtingą tinklelį (gardelę). Disacharido dalis susideda iš dviejų acetilintų amino cukrų, N - acetilo gliukozės aminas (NAC) ir N - acetilmuramo rūgštis (NAM, laktilo eteris N -acetilo gliukozės amino), kurie pakaitomis yra sujungti b -1, 4 glikozidine jungtimi.

3]. NAG ir NAM Sujungti linijiniu būdu sudaro 10-65 cukrų eilę ir sudaro angliavandenius stuburas. Trumpas peptidinis tetrapeptidas - keturių aminorūgščių grandinė. susideda iš L -alanino, D -glutamo rūgšties, Di amino plmelino rūgšties (DAP) arba L -lizino ir D -alanino, prisitvirtina prie stuburo NAM liekanos. Tetra peptide yra kintamas D ir L aminorūgščių modelis.

4]. Gramteigiamose bakterijose šie tetra peptidai yra sujungti kryžminiais ryšiais, kad susidarytų stiprus. tinklelis kaip polimeras. Paprastai galinio D-alanino karboksilo (-COOH) grupė tiesiogiai jungiasi su kito tetra peptido DAP arba L lizinu. penta peptido tarpusavio tiltas. Daugumai gramneigiamų bakterijų trūksta peptidų tarpusavio tilto. Tarp visų tetra peptidų ne visada egzistuoja peptidų tarpusavio tiltas.

Gramteigiamų ląstelių sienelių komponentai

1]. Gramteigiamų bakterijų ląstelių sienelės yra storos ir susideda iš kelių peptidoglikano sluoksnių (net 40). Be to, jie turi daug kitos makromolekulės, vadinamos teicho rūgštis.

2]. Teichoinės rūgštys yra glicerolio arba ribitolio polimerai, sujungti fosfatų grupėmis. Aminorūgštys, tokios kaip D-alaninas, arba cukrūs, tokie kaip gliukozė, yra prijungtos prie glicerolio arba ribltolio grupių. Teichoinės rūgštys gali būti kovalentiškai susietos su peptidoglikanu sienoje arba lipidais plazmos membranoje. Jie atitinkamai vadinami sienomis teichoic rūgštis arba Lipoteichoic rūgštis.

3]. Teichoinės rūgštys yra neigiamai įkrautos. todėl jie prisideda prie neigiamo ląstelių paviršiaus krūvio. Jie gali dalyvauti:
a). Įvažiavimo ar išvykimo reguliavimas
molekulės
b). Ląstelių lizės prevencija
c). Antigeniškumas
d). Priedas
bakteriofagai

Gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelių komponentai

Gramneigiamų bakterijų ląstelių sienos yra palyginti sudėtingesnės. Jame yra plonas peptidoglikalinis sluoksnis, apsuptas išorinės membranos, pagamintas iš lipopolisacharido.

Išorinę membraną sudaro lipopolisacharidai (LPS). Jį sudaro lipidai A, pagrindinis polisacharidas ir O šoninė grandinė. Išorinė membrana yra sujungta su vidiniu peptidoglikano sluoksniu unikaliu lipoproteinu, vadinamu Brauno lipoproteinu.

a). Lipidai A. nėra glicerolio lipidas. Jį sudaro du gliukozamino cukraus dariniai, kurių kiekvienas yra prijungtas prie trijų riebalų rūgščių ir fosfatų arba pirofosfatų. Ilgos grandinės riebalų rūgštys, kurios gali būti kaprono rūgštis, lauro rūgštis, miristino rūgštis, palmitino rūgštis arba stearino rūgštys, jungiasi prie gliukozamino (GKN) fosfatų esteraminas jungtis. Disacharidai prisijungia prie šerdies polisacharido, o riebalų rūgštys - prie išorinės membranos.

b). Pagrindinis polisacharidas susideda iš oligosacharido vieneto, pritvirtinto prie lipidų A gliukozamino liekanų. Jį sudaro keto-deoksioctonatas (KDO), septynių anglies cukrų (heptozė). gliukozė, galaktozė ir N-acetilgliukozaminas.

c). O-polisacharidas, taip pat vadinama O pusės grandinė arba O-antigenas, tęsiasi nuo šerdies. Jame yra keletas savitų cukrų, pvz. galaktozė (Gal), gliukozė (Gui), ramnozė (Rha) ir manozė (žmogus) Jie yra sujungti į keturių ar penkių narių sekas, kurios paprastai yra šakotos. Kartojant cukraus sekas, susidaro ilgas O-polisacharidas.

LPS yra porino baltymų. Jis yra vamzdžio formos. It permits the passage of molecules smaller than 600 to 700 Daltons.

Inner Membrane

1]. Inner membrane of gram - negative bacteria consists of a thin layer of peptidoglycan . The peptidoglycan layer is non - covalently anchored to lipoprotein molecules called Braun's lipoproteins through their hydrophobic head .

2]. Sandwiched between the outer membrane and the plasma membrane , a concentrated gel - like matrix ( the periplasm ) is found in the periplasmic space . This periplasmic space contains binding proteins for transport of nutrients in to the cell . The periplasm space can act as reservoir for virulence factors and a dynamic flux of macromolecules representing the cell's metabolic status and its response to environmental factors .


Identification of Two Phosphate Starvation-induced Wall Teichoic Acid Hydrolases Provides First Insights into the Degradative Pathway of a Key Bacterial Cell Wall Component

The cell wall of most Gram-positive bacteria contains equal amounts of peptidoglycan and the phosphate-rich glycopolymer wall teichoic acid (WTA). During phosphate-limited growth of the Gram-positive model organism Bacillus subtilis 168, WTA is lost from the cell wall in a response mediated by the PhoPR two-component system, which regulates genes involved in phosphate conservation and acquisition. It has been thought that WTA provides a phosphate source to sustain growth during starvation conditions however, WTA degradative pathways have not been described for this or any condition of bacterial growth. Here, we uncover roles for the Bacillus subtilis PhoP regulon genes glpQ and phoD as encoding secreted phosphodiesterases that function in WTA metabolism during phosphate starvation. Unlike the parent 168 strain, ΔglpQ or ΔphoD mutants retained WTA and ceased growth upon phosphate limitation. Characterization of GlpQ and PhoD enzymatic activities, in addition to X-ray crystal structures of GlpQ, revealed distinct mechanisms of WTA depolymerization for the two enzymes GlpQ catalyzes exolytic cleavage of individual monomer units, and PhoD catalyzes endo-hydrolysis at nonspecific sites throughout the polymer. The combination of these activities appears requisite for the utilization of WTA as a phosphate reserve. Phenotypic characterization of the ΔglpQ and ΔphoD mutants revealed altered cell morphologies and effects on autolytic activity and antibiotic susceptibilities that, unexpectedly, also occurred in phosphate-replete conditions. Our findings offer novel insight into the B. subtilis phosphate starvation response and implicate WTA hydrolase activity as a determinant of functional properties of the Gram-positive cell envelope.

Raktažodžiai: Bacillus enzyme kinetics enzyme mechanism glpQ gram-positive bacteria hydrolase phoD phosphate starvation wall teichoic acid.

© 2016 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.


2.3A: The Gram-Positive Cell Wall - Biology

After reading this section, students will.

  1. Be able to describe the function and location of the periplasm.
  2. Be able to describe the function of the cell wall and the two common cell wall structures.

The periplasm is between the cytoplasmic and outer membranes in Gram-negative bacteria

The periplasm is found in Gram-negative bacteria and is the space in between the cytoplasmic and outer membranes. (Some feel a periplasm-like compartment is also present in Gram-positive bacteria in between the cytoplasmic membrane and the peptidoglycan.) The periplasm is filled with water and proteins and is therefore somewhat reminiscent of the cytoplasm. However, pools of small molecules in the periplasm are not like those in the cytoplasm because the membrane prevents the free exchange between these two compartments. Also, the proteins found in the periplasm are distinct from those in the cytoplasm and are specifically guided to this site during translation through specific signal sequences typically near their N-termini. Table 3.2 lists some examples of these proteins.

The peptidoglycan shell that provides the strength to prokaryotic membranes is also found in the periplasmic space of Gram-negative bacteria, while in Gram-positive bacteria it provides the outside border to the periplasm.

Table 3.2 Different types of periplasmic enzymes and their role in the cell

Enzyme Type Pavyzdžiai Funkcija
Hydrolytic enzymes phophatases Degrading phosphate-containing compounds.
proteases Degrading proteins and peptides.
endonucleases Degrading nucleic acids.
Binding proteins sugars, amino acids, norganic ions, vitamins Binding substrates and docking with transport protein in membrane.
Chemoreceptoriai Chemotaxis, ermination Sensing the environment and changing cell behavior in response.
Detoxifying enzymes &beta-lactamase Degrading penicillin and related compounds before they get into the cell.

Periplasmic enzymes have several main functions, detecting nutrients in the environment, degradation of polymers, and protection from harmful compounds.

The cell wall surrounds and holds in the microbe

This section will restrict itself to the bacterial cell wall, but at the end of the chapter we will compare this to archaeal cell walls. The cell wall is essential to the survival of most microorganisms. Many microbes live in environments that are relatively dilute and the wall's most important function is to prevent the cell from bursting due to osmotic stress. The cell wall also determines the shape of the cell. Any cell that has lost its cell wall, either artificially or naturally, becomes roughly spherical and lyses due to osmotic pressure, unless placed in certain concentrated solutions. Finally, the cell wall helps to support any structure that penetrates from the cell out into the environment.

Figure 3.19. A gram-positive bacterium. Gram stain of the gram-positive bacterium Bacillus cereus

The structure and synthesis of prokaryotic cell walls is unique and many compounds found in the bacterial cell wall are found nowhere else in nature. It is true that plants also make cell walls, but they are chemically and structurally different. There are two basic types of bacterial cell wall structures that have been studied in detail: Gram-positive and Gram-negative. These two classes of bacterial cells look very different following staining with the Gram stain and this has been a standard test for for identification of bacterial species. Figures 2-19 and 2-20 show Gram stains of Gram-positive and Gram-negative bacteria, respectively.

Figure 3.20. A gram-negative bacterium. A Gram stain of the gram-negative bacterium Serratia marcescens

When the Gram stain was developed by Hans Christian Gram in 1884 the molecular basis of the stain was unknown. In fact very little was understood about bacteria in general. He just determined empirically that when bacterial smears were run through a four-step staining procedure using two different dyes, some cells retained the first dye and stained purple, while other only retained the second dye and stained pink. Years later it was discovered that the basis for this differential reaction relates to the cell wall as shown in Figure 3.21.

Figure 3.21. A comparison of the ultrastructure of gram-positive and gram-negative cells. The different Gram reactions occur because of structural differences between the bacterial cell walls. Gram-positive cells (Group B streptococci) appear smooth in a scanning electron micrograph (A) and are composed of a single layer of peptidoglycan (B). Gram-negative cells (E. coli) have an undulating surface and have three layers (C and D). (Sources: S. H. Pincus, ir kt.1992. J. Bacteriol 174:3739-3749 [panels A and B] M. E. Bayer and C. C. Remsen. 1970. J. Bacteriol. 101:304-313 [panel C] T. J. Beveridge. 1999. J. Bacteriol. 181:4725-4733 [panel D])

As shown in Figure 3.21, the Gram-negative cell has an additional layer and the outside of the cell appears convoluted when compared to the Gram-positive cell. The Gram-positive wall is much thicker than is the Gram-negative wall and its external appearance is smoother. Gram-positive and Gram-negative cells do share one thing in common that is unique to bacteria - peptidoglycan. We will talk about the structure of this and then move on to examine the various structures found in each cell wall type.

Peptidoglycan is a thick rigid layer composed of an overlapping lattice of two sugars, N-acetyl glucosamine (NAG) and N-acetyl muramic acid (NAM), that are cross-linked by amino acid bridges as shown in Figure 3.22. The exact molecular makeup of these cross-bridges is species-specific. NAM is only found in the cell walls of bacteria and nowhere else. Attached to NAM is a side chain generally composed of four amino acids. In the best-studied bacterial cell walls (E. coli) the cross-bridge is most commonly composed of L-alanine, D-alanine, D-glutamic acid and diaminopimelic acid (DPA).

Figure 3.22. The chemical structure of peptidoglycan. The generalized peptidoglycan monomer showing the two sugars that make up the backbone. The R group consists of four amino acids, with the best-studied cell walls containing L-alanine, D-alanine, D-glutamic acid and diaminopimelic acid.

Note that peptidoglycan contains D-amino acids, which are different than the L-amino acids found in proteins. D-amino acids have the identical composition as L-amino acids, but are their mirror images. The use of D-amino acids is unusual in biology and bacteria have enzymes called racemases to convert between D and L forms specifically for this use.

The NAM, NAG and amino acid side chain form a single peptidoglycan unit that can link with other units via covalent bonds to form a repeating polymer. The polymer is further strengthened by covalent bonds between cross-bridges and the degree of cross-linking determines the degree of rigidity. Figure 3.23 shows an artist's rendering of what the structure might look like. In E. coli, the penultimate D-alanine of one unit is linked to DPA of the next cross-bridge. In some Gram-positive microbes there is a peptide composed of various amino acids that serves as a link between the cross-bridges. Pavyzdžiui, į Staphylococcus aureus strains, five glycines make up the linker between peptidoglycan monomers. The sequence of these linkers varies considerably between species. The completed peptidoglycan layer forms a strong mesh that can be thought of as a chain link fence. The complete cell wall contains one or more layers of peptidoglycan one atop the other, providing much of the strength of the cell wall.

Figure 3.23. A cartoon of the peptiodglycan mesh. The peptidoglycan polymers then crosslink with other peptidoglycan chains to form a complex mesh that wraps the cell in a structure a kin to chicken wire.

While both Gram-negative and Gram-positive bacteria have peptidoglycan, its physical arrangement in the cell wall is different. In Gram-positive cells the peptidoglycan is a heavily cross-linked woven structure that encircles the cell in many layers. It is very thick with peptidoglycan accounting for 50% of weight of cell and 90% of the weight of the cell wall. Electron micrographs show the peptidoglycan to be 20-80 nm thick. In Gram-negative bacteria the peptidoglycan is much thinner with only 15-20% of the cell wall being peptidoglycan. In both cases, peptidoglycan is not a barrier to solutes, as the openings in the mesh are large enough for most molecules including proteins to pass through. Figure 3.24 shows a depiction of the Gram-positive cell wall.

Figure 3.24. The Gram-positive cell wall. The cell wall is made mostly of peptidoglycan, interspersed with teichoic acid which knits the different layers together. The amount of crosslinking is higher and the wall is thicker than in gram-negative cell walls.

The Gram-positive cell wall

Gram-positive cells consist almost entirely peptidoglycan, but an important structure found in Gram-positive cell walls is teichoic acid. It is a phosphodiester polymer of glycerol or ribitol joined by phosphate groups. Amino acids such as D-alanine are attached. Teichoic acid is covalently linked to muramic acid and stitches various layers of the peptidoglycan mesh together. Teichoic acid stabilizes the cell wall and makes it stronger. The chemical formula of teichoic acid is shown in Figure 3.25

Figure 3.25. Teichoic acid. Teichoic acid is a long, thin molecule that weaves through the peptidoglycan.

Gram-negative cell structure

Gram-negative cell walls have a more complicated structure than do those of Gram-positive organisms. Outside the cytoplasmic membrane is the periplasm, which contains the thin layer of peptidoglycan. The peptidoglycan in Gram-negative cells contains less cross-linking than in Gram-positive cells with no peptide linker. Covalently bound to the peptidoglycan is Braun's lipoprotein, which has a hydrophobic anchor that helps to strongly bind the peptidoglycan to the outer membrane. Figure 3.26 shows the arrangement of the Gram-negative cell wall.

Figure 3.26. The Gram-negative cell wall. The cell wall in Gram-negative bacteria contains much less peptidoglycan and is surrounded by an outer membrane. There is much less crosslinking between the peptidoglycan. LPS is also present in the outer membrane and penetrates into the surrounding environment.

The outer membrane of Gram-negative bacteria is another lipid bilayer similar to the cytoplasmic membrane, and contains lipids, proteins, and also lipopolysaccharides(LPS). It is a barrier to proteins and prevents enzymes secreted into the periplasm from floating away. The membrane has distinctive sides, with the side that faces the outside containing all the LPS. LPS is composed of two parts: Lipid A and the polysaccharide chain that reaches out into the environment. Lipid A is a derivative of two NAG units with up to 7 hydrophobic fatty acids connected to it that anchor the LPS in the membrane as shown in Figure 3.27. Attached to Lipid A is a conserved core polysaccharide that contains KDO, heptose, glucose and glucosamine sugars. The rest of the polysaccharide consists of repeating sugar units and this is called the O-antigen. The O-antigen varies among bacterial species and even among various isolates of the same species. Many bacterial pathogens vary the make-up of the O-antigen in an effort to avoid recognition by the host's immune system.

Figure 3.27. The structure of LPS. LPS is composed of three sections: the lipid A region, a conserved core polysaccharide, and a highly variable O-polysaccharide. (A) The chemical structure of LPS. (B) A molecular model of the outer membrane from Pseudomonas aeruginosa. Source (T. P. Straatsma, Pacific Northwest National Laboratory)

LPS confers a negative charge and also repels hydrophobic compounds including certain drugs and disinfectants that would otherwise kill the cell. Some Gram-negative species live in the gut of mammals and LPS repels fat-solubilizing molecules such as bile that the gal bladder secretes. This repulsion enables these bacteria to survive in this environment. The O-antigen and other molecules on the outer membrane are also used by certain viruses that infect bacteria, as a means to identify the correct hosts for infection.

LPS is medically important because when LPS is released from bacterial cells it is toxic to mammals and is therefore called endotoxin. It creates a wide spectrum of physiological reactions including the induction of a fever (endotoxins are said to be pyrogenic), changes in white blood cell counts, leakage from blood vessels, tumor necrosis and lowered blood pressure leading to vascular collapse and eventually shock. At high enough concentrations the LPS endotoxin is lethal.

There are fewer total proteins and fewer unique types of proteins in the outer membrane than in the cytoplasmic membrane. Porins are particularly important components because of their role in the permeability of the outer membrane to small molecules. Porins are proteins that form pores in the outer membrane large enough to allow passage of most small hydrophilic molecules. Figure 3.28 shows the structure of a porin at the molecular scale. All known porins have a similar structure, with the protein containing a central channel that allows the passage of molecules. This allows migration of these molecules into the periplasmic space for possible transport across the cytoplasmic membrane. Some porins in the outer membrane are general, doing simple discrimination on size and charge, but having little substrate specificity. Examples include OmpF that is selective for positively charged molecules and PhoE that is permeable to negatively charged molecules. Other porins are more specific. The best studied is LamB, which recognizes the sugar polymer maltooligosaccharide and transports it through the outer membrane. Very large or hydrophobic molecules cannot penetrate the outer membrane, so the outer membrane serves as a permeability barrier to at least some molecules.

Figure 3.28. The molecular structure of a porin. The view in (A) is from the outside of the cell looking at the membrane surface. The view in (B) is the perspective from the side (i.e. from the membrane). The porin has three protein subunits and the actual pore is the central triangular area in the top panel formed by the three subunits.

There are also other types of outer membrane proteins that are involved in various functions. OmpA in E. coli seems to connect the outer membrane to the peptidoglycan. Some pathogens contain outer membrane proteins that help them neutralize host defenses. Finally all Gram-negative bacteria contain high molecular weight proteins involved in the uptake of large substrates such as iron-complexes and vitamin B12.

The differences between the cell walls of Gram-positive and Gram-negative bacteria greatly influence the success of the microbes in their environments. The thick cell wall of Gram-positive cells allows them to do better in dry conditions because it reduces water loss. The outer membrane and its LPS helps Gram-negative cells excel in the intestines and other host environments. Table 3.3 summarizes the difference between Gram-negative and Gram-positive cell walls.

Table 3.3 Properties of cell walls

Nuosavybė Gram-teigiamas Gram-negative
Thickness of wall 20-80 nm 10 nm
Number of layers in wall 1 2
Peptidoglycan content >50% 10-20%
Teichoic acid in wall + -
Lipid and lipoprotein content 0-3% 58%
Protein content 0% 9%
Lipopolysaccharide 0 13%
Sensitive to penicillin Taip Mažiau jautrus
Digested by lysozyme Taip Weakly

A summary of the differences between Gram-positive and Gram-negative cell walls.

Some bacteria lack cell walls

For most bacterial cells, the cell wall is critical to cell survival, yet there are some bacteria that do not have cell walls. Mikoplazma species are widespread examples and some can be intracellular pathogens that grow inside their hosts. Cell walls are unnecessary here because the cells only live in the controlled osmotic environment of other cells. It is likely they had the ability to form a cell wall at some point in the past, but as their lifestyle became one of existence inside other cells, they lost the ability to form walls. Consistent with this very limited lifestyle within other cells, these microbes also have very small genomes. They have no need for the genes for all sorts of biosynthetic enzymes, as they can steal the final components of these pathways from the host. Similarly, they have no need for genes encoding many different pathways for various carbon, nitrogen and energy sources, since their intracellular environment is completely predictable. Because of the absence of cell walls, Mikoplazma have a spherical shape and are quickly killed if placed in an environment with very high or very low salt concentrations. Tačiau, Mikoplazma do have unusually tough membranes that are more resistant to rupture than other bacteria since this cellular membrane has to contend with the host cell factors. The presence of sterols in the membrane contributes to their durability by helping to increase the forces that hold the membrane together.


How Does Gram Staining Work?

Gram staining involves three processes: staining with a water-soluble dye called crystal violet, decolorization, and counterstaining, usually with safanin. Due to differences in the thickness of a peptidoglycan layer in the cell membrane between Gram positive and Gram negative bacteria, Gram positive bacteria (with a thicker peptidoglycan layer) retain crystal violet stain during the decolorization process, while Gram negative bacteria lose the crystal violet stain and are instead stained by the safranin in the final staining process. The process involves three steps:

  1. Cells are stained with crystal violet dye. Next, a Gram's iodine solution (iodine and potassium iodide) is added to form a complex between the crystal violet and iodine. This complex is a larger molecule than the original crystal violet stain and iodine and is insoluble in water.
  2. A decolorizer such as ethyl alcohol or acetone is added to the sample, which dehydrates the peptidoglycan layer, shrinking and tightening it. The large crystal violet-iodine complex is not able to penetrate this tightened peptidoglycan layer, and is thus trapped in the cell in Gram positive bacteria. Conversely, the the outer membrane of Gram negative bacteria is degraded and the thinner peptidoglycan layer of Gram negative cells is unable to retain the crystal violet-iodine complex and the color is lost.
  3. A counterstain, such as the weakly water soluble safranin, is added to the sample, staining it red. Since the safranin is lighter than crystal violet, it does not disrupt the purple coloration in Gram positive cells. However, the decolorized Gram negative cells are stained red.

Control

Antibiotic Treatment

Penicillin remains the drug of choice for S pyogenes . It is safe, inexpensive, and of narrow spectrum, and there is no direct or indirect evidence of loss of efficacy. Prior to the 1990's, S pneumoniae was also uniformly sensitive to penicillin but a recent abrupt shift in the usefulness of penicillin has occurred. The group D enterococci are resistant to penicillins, including penicillinase-resistant penicillins such as methicillin, nafcillin, dicloxacillin, and oxacillin, and are becoming increasingly resistant to many other antibiotics. Group B streptococci are often resistant to tetracycline but remain sensitive to the clinically achievable blood levels of penicillin, even though they have penicillin minimal inhibitory concentrations (MIC) considerably higher than those of S pyogenes . Although the duration of penicillin therapy varies with the degree of invasiveness, streptococcal pharyngitis is generally adequately treated with 10 days of antibiotic therapy, and pneumococcal pneumonia with 7-14 days. If penicillin allergy occurs, an alternative drug for treating pharyngitis is erythromycin, although sporadic erythromycin and tetracycline resistance has been reported, leaving clindamycin or the newer macrolides as possible treatments. The most important goal of therapy in acute streptococcal pharyngitis is still to prevent rheumatic fever. However, therapy also hastens clinical recovery, avoids suppurative complications and renders the patient non-infectious for others. In addition to antibiotics, the patient with S pyogenes myositis or necrotizing fasciitis requires surgical debridement. Lifelong prophylaxis against recurrences of rheumatic fever is achieved with long-acting penicillin or erythromycin. Sulfonamides will not eradicate the streptococcus and thus are not acceptable therapy for streptococcal pharyngitis, but sulfadiazine is effective for preventing recurrent attacks of rheumatic fever. Additional prophylactic coverage before some dental and surgical procedures is necessary in the presence of rheumatic heart disease or prosthetic heart valves. Although streptococcal pharyngitis is usually a benign, self-limited disease, therapy is important to prevent rheumatic fever. There is no convincing evidence that antibiotic therapy prevents glomerulonephritis. Disconcertingly, some patients in recent outbreaks of acute rheumatic fever do not give a history of preceding pharyngitis.

Methods of treating the asymptomatic pharyngeal carrier of S pyogenes remain controversial. Recent evidence suggests that up to 20% of children and young adults are carriers, the carrier state involves no risk to the carrier or to others, and it is frequently difficult to eradicate despite the exquisite sensitivity of the organism to penicillin in vitro. A similar failure of antibiotic therapy to eradicate nasopharyngeal carriage or to prevent reinfection with S pneumoniae also occurs.

Although antibiotic resistance in S pneumoniae is common in many parts of the world, in the United States such strains previously had a geographically limited focus. Recent widespread emergence of S pneumoniae resistant to penicillin and other antibiotics has become a microbial threat in the United States as well. Even cefotaxime and ceftriaxone resistance has been documented. Isolates must be carefully screened for susceptibility by oxacillin disc testing, with definitive MIC determination by the E test (A B Biodisk NA, Piscataway, NJ), a convenient and reliable method for detection of resistance to penicillin and extended spectrum cephalosporins.

It is inappropriate to universally treat of pregnant women who are carriers of group B streptococci, or their colonized neonates, for several reasons: the high carrier rate cost the associated high risk of penicillin hypersensitivity the potential increase in infections with penicillin-resistant organisms the difficulty in altering colonization of women (even when their sexual partners were also treated) and the low risk of neonatal disease. The controversy continues despite recent recommendations for universal screening of preg nant women and selective intrapartum chemoprophylaxis for screen-positive mothers with preterm labor, premature or prolonged rupture of membranes, fever in labor, multiple births or previous infants with group B streptococcal disease.

Clearly, penicillin has reduced the severe morbidity and mortality associated with S pneumoniae . The emergence of resistance has now forced re-evaluation of empiric therapy. Clinicians must report clusters of S pneumoniae infection and be aware of local patterns of resistance. Penicillin susceptible organisms show MICs ≤ 0.06 mg/ml, intermediate strains 0.1-1.0 mg/ml and high level resistant strains ≥ 2 mg/ml. For nonmeningeal infection by intermediate strains, parenteral penicillin at high dose can probably be used since the mechanism of resistance involves alteration in penicillin binding proteins (PBP) and saturation. For meningeal infection with intermediate strains or any infection by high level resistant strains only ceftriaxone and cefotaxime retain sufficient activity. Resistance even to these extended spectrum cephalosporins was first reported for the US in 1991. At this writing only vancomycin remains uniformly effective but as discussed below, its use incurs potential for selection of vancomycin resistant enterococci (VRE) or risk of transferring vancomycin resistance from enterococci to S pneumoniae .

Currently, no single agent is reliably bactericidal against enterococci. Serious infections with group D enterococci often require a classic synergistic regime combining penicillin or ampicillin with an aminoglycoside, designed to weaken the cell wall with the β-lactam and facilitate entry of the bacteriocidal aminoglycoside. Other β-lactam drugs with good activity against enterococci include piperacillin and imipenem. An alternate drug of choice is vancomycin, but vancomycin-resistant strains of enterococci have been isolated. Nosocomial acquisition of these resistant organisms is of grave concern.

This antibiotic resistance among the streptococci/enterococci is an increasing problem. Studies show that in vitro exchange of resistant DNA can occur in conjugation via plasmids and transposons, or in transduction with bacteriophages. The mechanisms involved in the in vivo genetic exchange are not clearly defined. Evidence is accumulating that other streptococci may be the important donors of resistance markers. Transposon transfer is thought to be the most likely mechanism in S pneumoniae , although point mutations also occur. In the setting of heavy β-lactam use, selective pressure is important in emergence of resistant strains. The first penicillin-resistant S pneumoniae were reported in 1967 in Australia and in 1974 in North America. In New Guinea, where the first penicillin-resistant strains were reported in 1971, one-third of S pneumoniae isolates from patients with severe pneumococcal disease were resistant by 1978. In Hungary in 1992, 69% of S pneumoniae isolates were penicillin resistant. This resistance is not β-lactamase mediated but due to alteration in PBP which results in decreased binding of penicillin by the organism, rendering the drug less effective and requiring higher concentrations for saturation. Some strains resistant to erythromycin or tetracycline also have been reported, as well as some multiply resistant strains. In South Africa, outbreaks of infection with strains of S pneumoniae resistant to β-lactam antibiotics (penicillins and cephalosporins) as well as to tetracycline, chloramphenicol, erythromycin, streptomycin, clindamycin, sulfonamides, and rifampin were reported in 1977. Although antibiotic resistance among S pneumoniae was infrequent in the United States, a major shift occurred from 1988 to 1990, resulting in the present situation of 15-25% of S pneumoniae intermediately or completely resistant to penicillin. Communities with “low prevalence” have 5-10% resistance. Single or multiply resistant strains are transmitted person to person, especially in settings of frequent salivary exchange, antibiotic use and hand-to-hand transmission (as in day care centers) or of crowding (corrections facilities, homeless shelters, nursing homes, military training groups). Control of the problem of emerging, antibiotic-resistant S pneumoniae is multifactorial: 1) surveillance for clusters of invasive disease, resistance and prevalent serotypes 2) education of physicians and the public about antibiotic use (decrease unnecessary antibiotic use for obviously viral infections and decrease antibiotic prophylaxis for otitis by use of intermittent or expectant dosing or of non β-lactam based prophylaxissulfa. Use topical treatment for impetigo, and short course therapies and narrow spectrum antibiotics) 3) adherence to infection control strategies in day care centers 4) aggressive promotion of the current 23-valent S pneumoniae vaccine and support of efforts to design a new vaccine effective in those ς years of age, analogous to the eminently successful Haemophilus influenzae type B vaccine (see Ch. 30) where bacterial polysaccharide is conjugated to protein to elicit a T cell-dependent response.

Among the enterococci, resistance to a wide variety of common antibiotics has emerged, with some strains resistant to all currently available antibiotics. There is no clinically proven treatment effective against enterococci multiply resistant to lactams, aminoglycosides, and vancomycin. The emergence of such organisms poses a stunning management dilemma. Resistance among the enterococci can be either intrinsic or acquired (by de novo genetic mutation or acquisition of DNA from resistant organisms). Enterococcal resistance to lactams is also mediated by altered PBP as in pneumococci, allowing cell wall synthesis even in the presence of antibiotic, or much less commonly by β-lactamase. Resistance to aminoglycosides is mediated by decreased uptake or aminoglycoside modifying enzymes, and to vancomycin by decreased cell wall affinity for glycopeptide antibiotics. Further research into the mechanisms of resistance and new class(es) of antibiotics is essential.

A final concern about emerging resistance among the enterococci is the potential for genetic transfer of resistance genes to more virulent pathogens: Staph aureus , S pneumoniae and even Gram-negative organisms. So significant is this threat of emerging enterococcal resistance that the Centers for Disease Control and Prevention has issued a document addressing national guidelines. These include recommendations for 1) education of physicians and the public about the impact of vancomycin resistant enterococci (VRE), 2) vigilant surveillance for and detection of VRE, 3) strict enforcement of infection control strategies in hospitals, and 4) prudent vancomycin use or monotherapeutic use of extended spectrum cephalosporins. In a recent study of vancomycin use in US hospitals, use was about equally divided for treatment of a specific isolate, for prophylaxis, and for empiric coverage. The recommendations discourage vancomycin use for routine surgical prophylaxis, empiric prophylaxis in the patient with febrile neutropenia, the low birth weight infant or patients with vascular or peritoneal catheters, treatment of a single blood culture positive for coagulase-negative staphylococci, primary treatment of antibiotic-associated colitis, attempted eradication of colonization by methicillin-resistant Staph aureus (MRSA), or selective decontamination of the gastrointestinal tract.

Skiepijimas

As chemotherapeutic management becomes more difficult because of the threat of resistance, prevention becomes more important. With the introduction of antibiotics, previously successful pneumococcal vaccines fell into disuse. However, although prompt treatment with antibiotics has reduced the serious consequences of S pneumoniae infections (pre-antibiotic mortality rate of 30%), the disease incidence remains unchanged, and attention has been redirected to vaccines for S pneumoniae as well as for other streptococci. Pneumococcal vaccines (containing the pneumococcal polysaccharides of the most prevalent serotypes) have been licensed in several countries, including the United States. Initial use shows them to be useful and safe, but they remain under-utilized. The spectre of multidrug resistant S pneumoniae may provide a new incentive for their use. In 1983, the United States Food and Drug Administration licensed a vaccine containing 23 serotypes, representing coverage against nearly 89% of the pneumococcal isolates submitted to the CDC in the 1987-1988 National Surveillance Study. The population target of pneumococcal vaccines includes those at high risk for serious pneumococcal disease: the elderly (65 and older) and children (2 years of age and older) with sickle cell anemia, with an immunocompromised state (lymphoma, asplenia, myeloma, acquired immunodeficiency syndrome), with nephrotic syndrome, or with chronic cardiopulmonary disease. Vaccines for the other streptococci remain experimental.

Vaccine production for the streptococci presents several formidable problems. For both S pyogenes ir S pneumoniae , a large number of serotypes must be included in effective vaccines since successful selection of a common epitope remains elusive. Continuing surveillance to determine prevalent serotypes is necessary to insure that the vaccine formulations remain appropriate. Dėl S pyogenes , it is critical to determine rheumatogenic and nephritogenic strains to limit the required multivalency of the vaccines. Alternatively a newly described conserved portion of M protein is a distant goal. Toxicity has been associated with M protein preparations, but lack of immunogenicity in highly purified preparations of antigens is still a problem. With streptococcal vaccines, the potential risk of antigenic cross-reactivity with cardiac tissue and an associated increased risk of acute rheumatic fever must be appreciated.

In group B neonatal disease chemoprophylaxis does not appear as practical as vaccine control. Passive immunity in group B streptococcal neonatal infection appears protective. Polyvalent hyperimmune gamma globulin and human monoclonal IgM antibody which reacts with multiple serotypes are undergoing efficacy studies. Active immunization of pregnant women with undegraded sialic acid-containing polysaccharide group B antigens is another important aspect of control.

The streptococci are ubiquitous, and their significance in medicine is remarkable. Exciting advances are being made in diagnosis and in understanding the mechanisms of pathogenesis, as well as in control of these well-known organisms. Problems with antibiotic resistance must preclude complacency in dealing with these common pathogens.