Informacija

Švitinimas turi teigiamą poveikį žmonėms?


Tyrimo dokumente Euphytica 135: 187-204, 2004 rašoma, kad:

Buvo išleista 434 ryžių mutantų veislės, kurių charakteristikos pagerėjo, pavyzdžiui, pusiau nykštukų ūgis, ankstyvas brandumas, geresnis grūdų derlius, atsparumas ligoms ir šalčiui bei geresnė grūdų kokybė. Iš jų 225 (56%) buvo sukelti gama spinduliais, 16- rentgeno spinduliais, 7- greitaisiais neutronais ir 12- kitais radiacijos šaltiniais.

Taigi matau, kad švitinimas gali turėti teigiamą poveikį augalų genomui.

Ar yra informacijos, kad tokiu būdu žmonėms sukeltos mutacijos jiems buvo naudingos? Ar švitinimas gali turėti teigiamą poveikį jūsų kūnui?


Kalbant apie jūsų pirmąjį klausimą, aš nežinau nė vieno atvejo, kai buvo švitinama naudojamas pasirinkti naudingą žmogaus savybę. Aš kursyvu rašiau „naudotas“, nes manau, kad galite teigti, jog natūraliai atsirandantys švitinimo šaltiniai atrinko bruožus, apsaugančius mus nuo radiacijos padarytos žalos.

Tai gali atrodyti kaip šiek tiek apskritas argumentas, tačiau atminkite, kad jūsų paminėtų ryžių atveju naudingų savybių atradimas įvyko daugelio negyvų ryžių sąskaita, kurie patyrė žalingą radiacijos poveikį. Deja, žalingo poveikio tikimybė yra daug didesnė nei bet kokio tikrai naudingo.

Tai veda prie jūsų antrojo klausimo. Tikėtina, kad radiacija galėtų sukelti naudingą mutaciją. Tačiau su tuo yra keletas didelių įspėjimų. Pirma, kad ši hipotetinė mutacija būtų naudinga, ji turėtų atsirasti labai anksti vystymosi pradžioje, nes priešingu atveju ji apsiribotų tik keliomis ląstelėmis, tikriausiai jūsų odoje, kurios bet kokiu atveju tiesiog atsikratytų . Antrasis įspėjimas yra tas, kad norint, kad tokia naudinga radiacijos sukelta mutacija atsirastų tinkamoje vietoje tinkamu vystymosi laiku, ji turėtų prasiskverbti į visus jūsų motinos genetinės medžiagos sluoksnius, atskiriančius jūsų vaisiaus ląsteles nuo išorinio pasaulio. neprarandant energijos, reikalingos jūsų DNR sugadinimui.

Negalėčiau jums pasakyti, kokia spinduliuotė galėtų ją pašalinti su kokia sėkmės tikimybe, tačiau manau, kad tai tikrai mažai tikėtina.


Teigiamas alosterinis moduliavimas ultravioletiniu spinduliu GABAA, bet ne GABAC, receptoriai, išreikšti Xenopus oocitai

Rekombinantinė žiurkių GABAA (㬑 㬢, 㬑 㬢 㬲, 㬢 㬲) ir žmogaus GABAC (㰑) receptoriai buvo išreikšti Xenopus oocitus, kad ištirtų ultravioletinės (UV) šviesos poveikį receptorių funkcijai.

GABA sukeltos srovės atskiruose oocituose, ekspresuojančiuose GABA receptorius, buvo išbandytos dviejų elektrodų įtampos spaustuku prieš ir iškart po 312 nm UV švitinimo.

UV spinduliavimas žymiai sustiprino 10 μ m GABA sukeltas sroves 㬑 㬢 㬲 GABA receptoriuose. Moduliacija priklausė nuo švitinimo dozės, maksimalus stiprinimas buvo daugiau nei 3 kartus.

Stiprinimas buvo iš dalies grįžtamas ir sumažėjo eksponentiškai, laiko konstanta buvo 8,2 ir#x000b1 1,2 min.

UV spindulių poveikis GABAA receptoriai skiriasi priklausomai nuo receptorių subvieneto sudėties. UV spinduliuotė sumažino EK50 iš GABA 㬑 㬢,#x003b11 㬢 㬲 irA receptorių, tačiau neturėjo reikšmingo poveikio 㰑 GABAC receptorius.

UV spinduliavimas taip pat žymiai padidino maksimalią srovę 2 kartus 㬑 㬢 GABAA receptorių, kurie mažai veikia didžiausią 㬑 㬢 㬲 (1,1 karto) arba 㬢 㬲 (1,1 karto) GABAA receptorių.

UV spindulių poveikis GABAA receptoriai nepersidengė GABA receptorių-allosterinio moduliatoriaus, diazepamo, poveikiu.

UV poveikis GABAA receptorių neapsaugojo nuo oocitų apdorojimo prieš UV spinduliuotę ir jos metu vienu iš šių laisvųjų radikalų šalintojų: 40 m m d -manitolio, 40 m m imidazolo arba 40 m m natrio azido. Be to, efekto nemėgdžiojo laisvųjų radikalų generatorius H.2O2.

Aptariama galimo UV poveikio GABA receptoriams reikšmė ir mechanizmas (-ai).

γ-amino sviesto rūgšties (GABA) surišti chlorido kanalai tarpininkauja greitam slopinančiam sinaptiniam perdavimui, taip kontroliuojant neuronų jaudrumą. Šie chlorido kanalai gali būti klasifikuojami į GABAA ir GABAC receptorių pagal jų farmakologines savybes. GABAA receptorius alosteriškai moduliuoja benzodiazepinai, barbitūratai ir neurosteroidai, o antagonizuoja bicukulinas, tuo tarpu GABAC receptoriai yra nejautrūs šiems junginiams (Woodward ir kt. 1992 Feigenspanas ir kt. 1993 Qian & Dowling, 1993 Macdonald & Olsen, 1994 Johnston, 1996 Lukasiewicz, 1996 Ueno ir kt. 1997). Šie du GABA receptorių tipai taip pat skiriasi savo fiziologinėmis savybėmis ir pasiskirstymu. Pavyzdžiui, GABAA receptoriai turi greitą aktyvacijos ir deaktyvavimo kinetiką ir ilgą laiką veikiant agonistams rodo didelę desensibilizaciją, tuo tarpu GABAC receptoriai turi lėtą kinetiką be reikšmingo desensibilizacijos (pjovimas) ir kt. 1991, Amin & Weiss, 1994). Nors GABAA receptoriai yra plačiai paplitę centrinėje nervų sistemoje ir tinklainėje, GABAC receptoriai daugiausia yra tinklainėje (Enz ir kt. 1995, 1996 Taip ir kt. 1996 m. Albrechtas ir kt. 1997 Wegelius ir kt. 1998).

Molekulinis klonavimas atskleidė kelis jonų kanalų subvienetus su GABA ir jų izoformas 㬑 𠄶,#x003b21 𠄴,#x003b31 𠄳,##0000c11 χ (Barnardas ir kt. 1987 m. Schofieldas ir kt. 1987 Khrestchatisky ir kt. 1989 Olsen & Tobinas, 1990 m ir kt. 1991 m. Garret ir kt. 1997 Hedblom & Kirkness, 1997 Whiting ir kt. 1997). Egzogeninė GABA receptorių ekspresija supaprastina tyrimus, išvengdama toje pačioje ląstelėje esančių heterogeninių GABA receptorių potipių komplikacijų. Tokie tyrimai atskleidė, kad skirtingos GABA fiziologinės ir farmakologinės savybėsA ir GABAC receptorių yra dėl jų subvienetų sudėties skirtumų. Rekombinantiniai ir#x003b1 β γ GABA receptoriai turi farmakologines ir fiziologines savybes, panašias į vietines GABAA receptoriai (Levitan ir kt. 1988 Pritchett ir kt. 1989 m. Malherbe ir kt. 1990 Sigelis ir kt. 1990 Verdoornas ir kt. 1990), tuo tarpu egzogeniškai ekspresuoti 㰑 homomeriniai GABA receptoriai turi savybių, panašių į natūralias GABAC receptoriai (pjovimas ir kt. 1991). Skirtingos skirtingų subvienetų sudėties receptorių farmakologinės savybės ir erdvinis pasiskirstymas yra pagrindas kuriant specifinius subvienetams skirtus terapinius metodus nemigai, epilepsijai ir kitiems neurologiniams sutrikimams gydyti.

Šiame tyrime mes pastebėjome, kad UV spinduliavimas turi skirtingą poveikį rekombinantinei GABAA ir GABAC receptorių. 㬑 㬢,#x003b22 㬲 ir 㬑 㬢 㬲 GABA receptorius gali sustiprinti ultravioletinė spinduliuotė, tuo tarpu 㰑 GABA receptoriai yra nejautrūs UV šviesai. GABA stiprinimasA receptoriai UV spinduliuote nesutampa su GABA poveikiuA receptorių-allosterinis moduliatorius, diazepamas. Molekulinio mechanizmo išaiškinimas galėtų palengvinti naujų GABA svarbių struktūrinių elementų nustatymąA receptorių funkciją. Tai taip pat galėtų padėti mums suprasti UV sukelto tinklainės pažeidimo patofiziologiją ir palengvinti žalos prevencijos ar panaikinimo strategijų kūrimą.


Radimas radiacijai atsparių kasos vėžio ląstelių silpnųjų vietų

VAIZDAS: (Kairėje) Ląstelių ciklas, nurodantis G2 kontrolinį tašką prieš pat M fazę, kuri reiškia ląstelių dalijimąsi. (Dešinėje) MIA PaCa-2 ląstelės buvo autofagijos teigiamos (LC3 teigiamos) praėjus 12 valandų po rentgeno spindulių. Priešingai. Peržiūrėti daugiau

Kreditas: Nacionaliniai kvantinių ir radiologijos mokslo ir technologijų institutai

Iš visų žinomų vėžio rūšių kasos vėžio potipis, vadinamas kasos latakų adenokarcinoma (PDAC), yra vienas agresyviausių ir mirtiniausių. Ši liga prasideda ląstelėse, sudarančiose tam tikrus mažus kasos kanalus, ir progresuoja tyliai, dažniausiai nesukeldama jokių simptomų, kol išplitę navikai iš tikrųjų netrukdo šiems kanalams arba išplinta į kitas vietas. PDAC yra ne tik sunku diagnozuoti, bet ir labai nereaguoja į turimus gydymo būdus. Visų pirma, mokslininkai pastebėjo, kad PDAC ląstelės paprastai gali išgyventi radioterapiją per mechanizmus, kurie iš esmės lieka nežinomi.

Dalis dr. Sumitaka Hasegawa ir kolegos Motofumi Suzuki ir Mayuka Anko, dalis Japonijos Nacionalinių kvantinių ir radiologinių mokslo ir technologijų institutų Radiacinės ir vėžio biologijos grupės, šiuo metu tiria, kodėl PDAC ląstelės yra tokios atsparios spinduliuotei ir ar yra būdas pralaužti savo gynybą. Naujausiame jų tyrime, paskelbtame Tarptautinis radiacijos onkologijos, biologijos, fizikos žurnalas, jiems pavyko atskleisti kai kurias paslaptis, kuriomis grindžiamas įdomus ryšys tarp atsparumo gydymui PDAC, ląstelių ciklo ir proceso, vadinamo autofagija-arba „savaiminis virškinimas“.

Kiekviena mūsų kūno ląstelė yra daugybės ląstelių ciklų, nuo vieno ląstelių dalijimosi iki kito, rezultatas. Kiekvienas ląstelių ciklas, schematiškai parodytas 1 paveiksle, yra chemiškai suskirstyta fazių seka, kurioje daugybė baltymų aktyviai kontroliuoja ląstelės augimą ir užtikrina saugų jos dalijimąsi. Kai aptinkama DNR žala, ląstelių ciklas sustabdomas vadinamajame G2 kontroliniame taške ir dalijimas atidedamas, kol problema bus išspręsta. Daugelio rūšių vėžiu, įskaitant PDAC, G2 kontrolinis taškas yra stipriai suaktyvinamas po švitinimo, o tai padidino atsparumą terapijai.

Kita vertus, autofagija yra natūralus mechanizmas, kuriuo ląstelė virškina kai kuriuos savo organelius ir baltymus, ypač pažeistus ar nereikalingus, kad susigrąžintų maistines medžiagas ir palaikytų tinkamas vidines sąlygas, be kitų funkcijų. Nors tai yra būtina sveikoms ląstelėms, tyrėjai nustatė, kad vėžinių ląstelių autofagija padidėja iškart po gydymo spinduliuote ir kad tai iš tikrųjų padeda jiems ištverti ir išgyventi.

Įdomiausia, kad kadangi autofagija ir G2 kontrolinis taškas turi tuos pačius cheminius signalus, buvo pasiūlyta, kad šie du procesai yra tarpusavyje susiję. "Nors buvo pasiūlytas ryšys, mechaninės detalės apie autofagijos ir G2 kontrolinio taško sąveiką po švitinimo buvo neaiškios. Taigi, neseniai atliktame tyrime siekėme daugiau sužinoti apie šių procesų ryšį, ypač PDAC ląstelėse". aiškina daktaras Hasegawa.

Po daugybės eksperimentų su PDAC ląstelių kultūromis, mokslininkų komanda, vadovaujama daktaro Hasegawa, nustatė, kad švitinimo sukelta autofagija priklauso nuo aktyvuoto G2 kontrolinio taško. Be to, jie parodė, kad autofagija padėjo apšvitintoms PDAC ląstelėms generuoti daugiau energijos (molekulės, vadinamos ATP), o tai savo ruožtu lėmė jų išgyvenimą. Taigi komanda pradėjo analizuoti, kas atsitiko su apšvitintomis PDAC ląstelėmis, kai chemiškai buvo slopinamas G2 kontrolinis taškas. Šios apšvitintos ląstelės, kurios negalėjo suaktyvinti G2 kontrolinio taško, nepatyrė autofagijos, todėl buvo daug didesnė tikimybė mirti po radiacijos (2 pav.).

Šie daug žadantys rezultatai buvo išbandyti su pelėmis, į kurias buvo persodintos PDAC ląstelės, kad susidarytų navikai. Gydydami šias peles ir radiacija, ir G2 kontrolinio taško inhibitoriumi, mokslininkams pavyko labai slopinti naviko augimą, lyginant su tuo, kai buvo švitinama vien tik (3 pav.). Iš esmės tai reiškia, kad G2 kontrolinio taško slopintuvai, kurie taip pat sušvelnina autofagiją, galėtų būti veiksmingai naudojami kaip įrankiai, mažinantys PDAC ląstelių atsparumą radiacijai. "Mūsų tyrimai," daro išvadą daktaras Hasegawa, "turėtų palengvinti radiosensibilizatorių ar naujų radioterapinių PDAC strategijų kūrimą. Savo ruožtu tai iš esmės galėtų pagerinti pacientų, sergančių šio tipo vėžiu, išgyvenamumą."

Norint geriau suprasti ryšį tarp G2 kontrolinio taško ir autofagijos ir kaip šie procesai daro vėžio ląsteles atsparesnes, reikės atlikti tolesnius tyrimus. Tikėkimės, kad mokslininkai pagaliau ras būdų, kaip veiksmingai kovoti su ypač sunkiais vėžio tipais, tokiais kaip PDAC, ir nukentėjusiems žmonėms suteikti daugiau gyvenimo metų.

Tyrimo straipsnis: Spinduliuotės sukelta autofagija žmogaus kasos vėžio ląstelėse labai priklauso nuo G2 kontrolinio taško aktyvavimo: radioaktyvaus kasos vėžio mechanizmo, Tarptautinis radiacijos onkologijos, biologijos, fizikos žurnalas, Motofumi Suzuki, Mayuka Anko, Maki Ohara, Ken-ichiro Matsumoto ir Sumitaka Hasegawa, DOI: https: / / doi. org/ 10. 1016/ j. ijrobp. 2021. 04. 001

Apie Dr. Sumitaka Hasegawa iš Nacionalinių kvantinių ir radiologinių mokslo ir technologijų institutų, Japonija:

Sumitaka Hasegawa yra gydytoja-mokslininkė, šiuo metu Japonijos Nacionalinių kvantinių ir radiologinių mokslo ir technologijų institutų Radiacinės ir vėžio biologijos grupės vadovė. Jis baigė Nagasakio universiteto biomedicinos mokslų aukštąją mokyklą, baigęs Nagasakio universiteto medicinos mokyklą. Doktorantas dirbo UCLA ir Stanfordo universitete. Jis turi daug publikacijų vėžio tyrimų, radiacinės onkologijos ir branduolinės medicinos srityse, įskaitant prestižinius žurnalus, tokius kaip „Nature“, „Science“, „Journal of the American Chemical Society“ ir „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America“.

Apie Japonijos nacionalinius kvantinių ir radiologijos mokslo ir technologijų institutus: Nacionaliniai kvantinio ir radiologinio mokslo ir technologijų institutai (QST) buvo įsteigti 2016 m. Balandžio mėn., Siekiant visapusiškai ir integruotai skatinti kvantinį mokslą ir technologijas. QST misija yra pakelti kvantinių ir radiologinių mokslų ir technologijų lygį, įsipareigojant tirti ir plėtoti kvantinį mokslą ir technologijas, spinduliuotės poveikį žmonėms, radiacinę skubią mediciną ir medicininį radiacijos naudojimą. Siekdama užtikrinti, kad moksliniai tyrimai ir plėtra duotų didelį akademinį, socialinį ir ekonominį poveikį, ir kad būtų kuo daugiau naudos iš pasaulinių naujovių, „QST“ siekia sukurti pasaulyje pirmaujančias mokslinių tyrimų ir plėtros platformas ir tyrinėti naujas sritis. Svetainė: https: / / www. qst. eiti. jp/ site/ qst-english/

Informacija apie finansavimą: Šį tyrimą rėmė Japonijos mokslo skatinimo draugija KAKENHI (dotacijos numeris 18K15653 [MS]) ir Nacionalinių kvantinių ir radiologinių mokslo ir technologijų institutų stipendijos.

Žiniasklaidos kontaktas: Ryšių su visuomene skyrius
Valdymo ir planavimo departamentas, QST
Tel: +81-43-206-3026 El. Paštas: [email protected]

Atsakomybės apribojimas: AAAS ir „EurekAlert“! neatsako už „EurekAlert“ paskelbtų naujienų pranešimų tikslumą! prisidedančioms institucijoms arba už bet kokios informacijos naudojimą per „EurekAlert“ sistemą.


Rezultatai

Pacientų, sergančių krūties vėžiu, išgyvenimas po radioterapijos priklauso nuo stadijos

Norėdami įvertinti prognozuojamą TP53 mutacijų poveikį reaguojant į γ spinduliuotę, ištyrėme viešai prieinamas metabric kohortos retrospektyvių klinikinių duomenų duomenų bazes (2433 krūties vėžiu sergantys pacientai, http://www.cbioportal.org). Visų krūties invazinės latakų karcinomos (BIDC) stadijų analizė kartu parodė, kad radioterapija pagerino bendrą išgyvenamumą (OS) visiems pacientams, nepriklausomai nuo mutacijos profilio (1a, b pav.). BIDC pacientų stratifikacija pagal stadiją parodė reikšmingą nuo stadijos priklausomą spindulinės terapijos naudą 2 stadijoje, palyginti su 1 stadijos kohorta (1c pav., D). Stebėtina, kad stratifikacija pagal p53 būseną BIDC ErbB2 kohortoje parodė, kad 1 stadijos pacientų, turinčių bendrą mutantinį TP53 TP53ErbB2 navikai (1f pav.). Priešingai, radioterapija šiek tiek išplėtė pacientų, sergančių laukinio tipo TP53 navikais, OS nepriklausomai nuo stadijos (1g pav., H). Taigi pacientams, sergantiems krūties vėžiu ErbB2, bendra mutanto TP53 būklė gali nuspėti neigiamą genotoksinių metodų baigtį 1 stadijoje, tuo tarpu tai yra labai naudinga 2 stadijai. 1 etape (papildomas 1a pav.), bet palankus rezultatas 2 etape (papildomas 1b pav.). Nors atvejų skaičius apribojo statistinį reikšmingumą, ši tendencija nebuvo pastebėta pacientams, sergantiems laukinio tipo TP53 krūties vėžiu sergantiems pacientams po chemoterapijos (papildomas 1c pav., D). Svarbu tai, kad p53LOH dažnis padidėjo naviko progresavimo metu: 52% 1 stadijos pacientų yra heterozigotiniai p53, o tik 20% 2 stadijos pacientų išlaiko wtp53 alelį (1i pav.).

Pacientų, sergančių krūties vėžiu, išgyvenimas po spindulinės terapijos priklauso nuo stadijos. Kaplan-Meier išgyvenamumo kreivė pacientams (n = 2433) krūties vėžiu gydomas spindulinis gydymas (raudona linija) arba negydomas (mėlyna linija). a Visi krūties vėžiu sergantys pacientai (p = 0.00079). b Pacientai, turintys TP53 ir ErbB2 mutacijas (n = 193, p = 0.033). c 1 etapas, visi krūties vėžiu sergantys pacientai (n = 440, p = 0.98). d 2 etapas, visi krūties vėžiu sergantys pacientai (n = 759, p = 0.00026). e 1 stadijos pacientai, turintys TP53 ir ErbB2 mutacijas (n = 35, p = 0.049). f 2 stadijos pacientai, turintys TP53 ir ErbB2 mutacijas (n = 70, p = 0.0019). g 1 stadijos pacientai, sergantys laukinio tipo p53 (n = 302, p = 0.26). h 2 stadijos pacientai, sergantys laukinio tipo p53 (n = 458, p = 0.017). i TP53 LOH krūties vėžiu sergantiems pacientams priklauso nuo stadijos. 52% I stadijos ir tik 20% II stadijos mutp53 navikų išlaiko wtp53 alelį.

Todėl mes iškėlėme hipotezę, kad p53LOH būsena gali būti svarbus veiksnys, lemiantis pacientų, turinčių mutantinius TP53 navikus, išgyvenimą po genotoksinio gydymo.

Γ-apšvitinimas apsunkina pieno navikogenezę ir skatina p53LOH MMTV-ErbB2 pelės modelyje

Norėdami apibendrinti ankstyvąsias žmogaus ErbB2 krūties vėžio stadijas ir ištirti p53LOH poveikį genotoksinio gydymo kontekste, mes sukūrėme genetinį pelės modelį, kaip aprašyta anksčiau 12. Pelės R172H (vėliau H) p53 mutacija atitinka žmogaus hotspot R175H mutaciją ErbB2 krūties vėžiu 4 ir (http://www.cbioportal.org)). Mes nustatėme, kad p53H/+ErbB2 pelėms, palyginti su p53 nuliniais analogais, pablogėjo ErbB2 krūties naviko atsiradimas, rodo ankstesnis naviko atsiradimas ir trumpesnis išgyvenamumas (2 pav., 1 lentelė, 12). Be to, viena γ spinduliuotės dozė priešpiktybinių pažeidimų atsiradimo metu (nuo 5 Gy iki 80 dienų amžiaus pelėms) žymiai sutrumpino naviko latentinį laiką ir bendrą išgyvenamumą maždaug 80 dienų tiek p53-/+ErbB2, tiek p53H/+ErbB2 genotipai (2a pav.), Bet ne p53+/+ErbB2 pelėse (2b pav.). Pažymėtina, kad švitinimas padidino p53LOH tiek p53H/+ErbB2 (2c pav.), Tiek p53 -/+ErbB2 (1 lentelė) navikuose. Be to, p53LOH dažniau pasireiškė esant mutp53 aleliui tiek neapšvitintame p53H/+ErbB2, tiek p53-/+ErbB2 (atitinkamai 18 ir 11%, 1 lentelė), ir šis skirtumas padidėjo po švitinimo (p53H/+ErbB2 95%, palyginti su p53 -/+ErbB2 atitinkamai 38%, 1 lentelė). Nors mes nepastebėjome išgyvenamumo skirtumo tarp p53H/+ErbB2 ir p53 -/+ErbB2, pagrindinis su sustiprintu p53LOH susijęs fenotipas buvo padidėjęs metastazių dažnis esant mutp53 aleliui (p53H/+ErbB2 100%, palyginti su p53+/ −ErbB2 58%, 1 lentelė). Priešingai, p53+/+ErbB2 pelių švitinimas nepadidino metastazių, ir mes negalėjome aptikti wtp53 alelio praradimo navikuose po švitinimo p53+/+ErbB2 pelėmis (1 lentelė).

γ-apšvitinimas apsunkina pieno navikogenezę ir skatina p53LOH MMTV-ErbB2 pelės modelyje. a, b Apšvitinto ir neapšvitinto MMTV-ErbB2 pelės modelio Kaplan-Meier išgyvenimo kreivės. Vienkartinė 5 Gy γ spinduliuotės dozė priešpiktybinių pažeidimų atsiradimo metu (80 dienų) apsunkina p53H/+ErbB2 naviko vystymąsi, palyginti su p53-/+ErbB2 (p & lt 0,001 ir p = 0,04, atitinkamai) (a), bet ne p53+/+ErbB2 pelėse (p = 0.892) (b). n reikšmės nurodytos paveikslėlyje ir reiškia pelių skaičių. c LOH analizės pavyzdys p53H/+ErbB2 pelių navikuose. Neapšvitintos pelės LOH rodo tik kelioms pelėms (viršutinės 7–9 juostos). Apšvitintos pelės, rodančios LOH visose pelėse, išskyrus 1 (apatinė 17 juosta). d P53 ekspresija ląstelių linijų skydelyje, nustatyta iš MMTV-ErbB2 pelių, turinčių skirtingus p53 genotipus, navikų. HSC70 yra pakrovimo valdiklis. e Mutp53 sustiprina LOH po γ apšvitinimo ląstelių kultūroje (n = 3 nepriklausomi mėginiai Klaidų juostos reiškia ± SD). Kultivuotos pieno navikų ląstelės buvo apšvitintos (9 Gy) arba ne, ir augintos iki 25 dienų po švitinimo. DNR buvo išgauta nurodytais laiko momentais. P53 masės ir mutinių alelių kopijų skaičius buvo kiekybiškai įvertintas PCR realiu laiku. DNR, išgauta iš atitinkamo genotipo uodegos audinių mėginių, buvo naudojama kopijų skaičiui kontroliuoti. Eksperimentas buvo pakartotas tris kartus. Reprezentatyvaus eksperimento santrauka. f Wtp53 išlaiko transkripcijos aktyvumą ir, reaguodamas į Mdm2 inhibitorių nutliną, sukelia savo tikslinį p21 ir Mdm2 mutp53 heterozigotinėse ląstelėse. Nutlin nesukelia Mdm2 p53H/HErbB2 ir p53 -/ - ErbB2 MEC. n = 3 nepriklausomi eksperimentai. Klaidų juostos reiškia ± SD.

Tada mes nustatėme, ar mutp53 alelio buvimas pagreitina p53LOH po švitinimo in vitro. Ląstelių linijos, sukurtos iš skirtingų genotipų pelių navikų (2d pav. Ir papildomas 2a pav.), Buvo apšvitintos arba ne, o wtp53 ir mutp53 alelių kopijų skaičius buvo nustatytas skirtingais laiko momentais pagal qPCR (2e pav.). Sutikdamas su in vivo duomenimis (1 lentelė), p53H/+ErbB2 radome 3 kartus mažesnį wtp53 alelio po švitinimo, palyginti su neapdorotomis ląstelėmis (5 kartus mažesnis, palyginti su kontrolinėmis p53+/+ErbB2 ląstelėmis), bet ne p53-/+ ErbB2 ląstelės, palyginti su neapšvitintomis ląstelėmis (2e pav.). Švitinimas sukėlė 2 kartus mažesnį laukinio tipo alelio kopijų skaičių p53+/+ErbB2 ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (2e pav.).

Norėdami įvertinti p53LOH pasekmes in vitro, atsižvelgiant į wtp53 transkripcinį aktyvumą heterozigotiškume, mes ištyrėme kanoninių p53 tikslinių genų Mdm2 ir p21 išraišką, reaguojant į Mdm2 inhibitorių, nutliną, naudojant qPCR. Nutlin skatina p53 transkripcijos aktyvumą nesukeliant DNR pažeidimo 13. Tarp p53+/+ErbB2 ir p53H/+ErbB2 ląstelių bazinio lygio reikšmingo Mdm2 ir p21 ekspresijos skirtumo nepastebėta, o abiejų išraiška padidėjo pridėjus nutliną (2f pav.). Priešingai, nutlin nepavyko sukelti p53 taikinių p53H/HErbB2 ir p53 -/ - ErbB2 pieno epitelio ląstelėse (MEC) (2f pav.). Taigi, esant heterozigotiškumui, wtp53 bent iš dalies išsaugo savo transkripcijos funkciją, o p53LOH gali panaikinti wtp53 naviko slopinimo veiklą.

Švitinimas sukelia mutantinio p53 baltymo kaupimąsi heterozigotinėse vėžio ląstelėse

Dauguma homozigotinių žmogaus mutp53 vėžio ir ląstelių linijų kaupia didelį mutp53 baltymų kiekį, tačiau mažai žinoma, kaip mutp53 baltymų lygis reguliuojamas heterozigotiškumu. Remiantis mūsų ankstesniu R248QMMTV-Neu pelės modelio 11 tyrimu, p53H/+ErbB2 navikuose radome tik 10-15% p53 teigiamų ląstelių, o p53-/+ErbB2 ir p53+/+ErbB2 navikuose nepastebėta. 3a ir papildomas 2b pav.). Švitinimo sukeltas p53LOH p53H/+ErbB2 pieno navikuose buvo susijęs su reikšmingu mutp53 baltymo stabilizavimu in vivo (3a pav. Ir papildomas 2b pav.) Ir ląstelių linijose, sukurtose iš pieno navikų, kuriems in vivo buvo atliktas p53LOH 9–11 juostos ir papildomas 2a pav.). Priešingai, švitinimas neturėjo įtakos wtp53 lygiui p53+/+ErbB2 ir p53 -/+ErbB2 navikuose (3a pav. Ir papildomas 2b pav.). Šie rezultatai atitinka Li ir kt. praneša, kad švitinimas stabilizuoja mutp53 baltymą MDA231 ląstelėse ir taip skatina proliferaciją 14. Kadangi buvo pasiūlyta, kad mutp53 baltymų stabilizavimas navikuose yra būtinas jo onkogeninei funkcijai 15, p53LOH su vėlesniu mutp53 stabilizavimu gali būti pagrindinis vėžio progresavimo įvykis in vivo.

Švitinimas sukelia mutantinio p53 baltymo kaupimąsi heterozigotinėse vėžio ląstelėse. a P53LOH padidėjimas p53H/+ErbB2 pieno navikuose yra susijęs su mutp53 stabilizavimu po švitinimo prieš piktybinius pažeidimus, o švitinimas neturi įtakos p53+/+ErbB2 ir p53-/+ErbB2 navikų wtp53 lygiui. Reprezentatyvūs pieno navikų p53 IHC vaizdai su nurodytais genotipais, kurie nebuvo apšvitinti ir apšvitinti. Buvo analizuojami keturi navikai vienam genotipui. Mastelio juosta yra 50 μm. b Švitinimas stabilizuoja mutp53 baltymą mutp53 heterozigotiniuose navikuose, bet ne p53 -/+ErbB2 navikuose. Western blot 16 valandų po švitinimo in vivo. Aktinas yra pakrovimo valdiklis. c wtp53 p53+/+ErbB2 ląstelėse buvo laikinai laikinai sureguliuotas praėjus 2 valandoms po švitinimo (9 Gy), mutp53 rodo daug didesnį ir nuolatinį stabilizavimąsi p53H/+ErbB2 ląstelėse. HSC70 yra pakrovimo valdiklis. d Švitinimas in vitro nesukelia p53 mRNR p53H/+ErbB2 ląstelėse, praėjus 24 valandoms po švitinimo. n = 3 nepriklausomi eksperimentai. *p & lt 0,05 **p & lt 0,01 ***p & lt 0,001. Klaidų juostos reiškia ± SD.

Pelių navikų Western blot tyrimas praėjus 16 valandų po švitinimo parodė, kad apšvitintame p53H/+ErbB2 navike mutp53 baltymas buvo stabilizuotas iki didesnio lygio nei neapšvitintas p53H/+ErbB2 navikas, o p53 p53-/+ErbB2 navikuose liko neaptinkamas (1 pav.). . 3b). Panašiai, wtp53 p53+/+ErbB2 ląstelių linijoje buvo tik laikinai reguliuojamas 2 valandas po švitinimo, tačiau mutp53 parodė daug didesnį lygį p53H/+ErbB2 ląstelių linijoje iki 24 valandų po švitinimo (3c pav. Ir papildomas 2c pav.).

Anksčiau buvo įrodyta, kad mutp53 mRNR yra sureguliuota reaguojant į genotoksinius antraciklinus žmogaus ląstelių linijose 16. P53 mRNR lygio analizė parodė, kad po švitinimo p53H/+ErbB2 ląstelėse p53 mRNR nepadidėjo (3d pav.), O tai rodo, kad po transkripcijos reguliuojamas mutp53 baltymų kiekis heterozigotiškumo po švitinimo metu. Taigi mes iškėlėme hipotezę, kad heterozigotinėse ląstelėse švitinimas stabilizuoja mutp53 virš ribos, kurios pakanka skatinti jo onkogeninę veiklą, dėl kurios atsiranda p53LOH ir naviko progresavimas.

P53LOH yra susijęs su perėjimu nuo HRR prie NHEJ ir genomo nestabilumu

Genominis nestabilumas, pvz., Chromosomų pertvarkymas, kurį daugiausia sukėlė normalios chromosomų atskyrimo nesėkmė mitozės metu, buvo laikomas viena iš pagrindinių LOH priežasčių vėžiu 17, 18. Daugelio genų, pvz., P53 ir PI3K, mutacijos trukdo normaliai mitozei, dėl kurios atsiranda chromosomų aberacijų 17. Arba įvairių onkogeninių mutacijų kaupimasis vėžio progresavimo metu gali būti neefektyvaus DNR taisymo rezultatas. Todėl mes įvertinome du pagrindinius DNR atstatymo mechanizmus ErbB2 pieno navikuose su įvairiais p53 genotipais.

Wtp53 aktyvuojamas reaguojant į genotoksinį gydymą, sukeliant ląstelių ciklo sustojimą, DNR atstatymą ir (arba) apoptozę 19, 20. Priklausomai nuo ląstelių konteksto ir DNR pažeidimo masto, p53 gali skatinti DNR atstatymą vienu arba abiem pagrindiniais taisymo būdais: (1) homologinis rekombinacinis remontas (HRR) 21, 22 ir (2) nehomologinis galinis sujungimas ( NHEJ) 22,23,24. HRR yra palyginti lėtas ir mažiau linkęs į klaidas, o NHEJ yra greitesnis ir labiau linkęs į klaidas 25.

HRR (Rad51 kaip žymeklis) buvo aktyvuotas p53+/+ErbB2, p53 -/+ErbB2, p53H/+ErbB2 ir p53 -/ - ErbB2, bet buvo slopinamas p53H/−ErbB2 ir p53H/HErbB2 pieno navikuose (4a pav. Ir Papildomas 3a pav.). Priešingai, wtp53 slopino NHEJ (Ku70 kaip žymeklis), tuo tarpu didesnis Ku70 dažymas buvo tik augliuose, kuriems trūko wtp53 (4b pav. Ir papildomas 3b pav.). Taigi mes iškėlėme hipotezę, kad atsižvelgiant į p53 būseną, wtp53 alelio buvimas gali perkelti DNR taisymo mechanizmą į HRR, o praradus wtp53 alelį (LOH), pereinama prie NHEJ taisymo, kai mutp53 aktyviai slopina HRR ir sukelia daugybinių mutacijų, mitozinių anomalijų ir chromosomų aberacijų įgijimas.

P53LOH yra susijęs su perėjimu nuo homologinio rekombinacinio remonto (HRR) prie nehomologinio galinio sujungimo (NHEJ) ir genomo nestabilumo. a Rad51 (HRR žymeklis) IHC pelių, nurodytų p53 genotipuose, ErbB2 pieno navikuose. b Ku70 (NHEJ žymeklis) pelių, nurodytų p53 genotipuose, ErbB2 pieno navikuose. Buvo nudažyti keturi pieno navikai vienam genotipui. c H & ampE dažymas normalioje anafazėje, parodantis atskirtas chromosomų mases ir jungiantis (rodyklė) tarp atskirtų chromosomų masių anafazės metu. d p53 IHC dažymas navikuose nuo flR248Q/−ErbB2 pelės, įpurškiamos aliejumi, arba po to, kai po tamoksifeno injekcijos navikas išseko iš flR248Q/-ErbB2 pelės. Skalės juostos A – D yra 50 μm. A – D vaizdai yra tipiški dažai iš 10 pelių kiekvienoje grupėje. e Anafazinių tiltų (AB) kiekybinis įvertinimas pelių, nurodytų p53 genotipuose, ErbB2 pieno navikuose. n = 3 navikai vienam genotipui. *p & lt 0,05 **p & lt 0,01 ***p & lt 0,001. f Mitozinių verpsčių dažymas mitozinėje ląstelėje (metafazėje) p53H/-ErbB2 pelės pieno navike (a, e). Branduolinis dažymas (DAPI), (b, f) centrosomos (γ-tubulinas), (c, g) mitoziniai velenai (α-tubulinas), (d, h) sujungti. ad mitozinė ląstelė su normaliais (2) ašies poliais ir 2 centrosomomis. eh mitozinė ląstelė be centrosomų (acentrosominių) ir nenormalių (& gt2) ašies polių. Rodyklės rodo centrosomų padėtį mitozinėje ląstelėje. Žvaigždutės nurodo tris acentrosominių veleno polių traukimo kryptis. Duomenys atspindi 10 vaizdų iš 4 pelių vienam genotipui. Mastelio juosta yra 145 μm.

Chromosomų aberacijas galima išmatuoti pagal „anafazinių tiltų“ (AB) dažnį ląstelių ciklo anafazėje. AB yra išplėstinis chromosomų tiltas tarp dviejų ašies polių (4c pav.) Ir yra histologinis dicentrinių 26 chromosomų požymis. Įrodyta, kad aukštas AB yra susijęs su padidėjusiu Apc LOH dažniu gaubtinės žarnos vėžio pelių modelyje 18. Mes nustatėme nedidelį AB balų skirtumą tarp p53+/+ErbB2, p53 -/+ErbB2 ir p53H/+ErbB2 pieno navikų, tuo tarpu wtp53 alelio nebuvimas žymiai padidino AB ErbB2 pieno navikuose (4c pav.). Be to, p53H/−ErbB2 navikai turėjo didesnį AB, palyginti su p53 -/ - ErbB2 navikais, o AB dar labiau padidėjo p53H/HErbB2 navikuose (4e pav.). Be to, mes ištyrėme kitą ErbB2 pelės modelį su sąlyginiu R248Q mutp53 alelio (flQ/−ErbB2) ištrynimu, kai buvo skiriamas tamoksifenas 15. Genetinė R248Qp53 abliacija in vivo reikšmingai sumažino mutp53 ekspresiją nustatytuose ErbB2 navikuose, lyginant su nešikliu gydytais navikais (4d pav.), Ir kartu buvo ir dvigubai mažesnis AB (4e pav.). Taigi, mūsų rezultatai rodo padidėjusį AB nepriklausomai nuo p53 mutacijos tipo, palyginti su p53 -/ - navikais (4e pav.).

Keletas tyrimų parodė centrosomų anomalijas ir mitozinį daugiapolį verpstės formavimąsi, kaip įvairių žmogaus navikų chromosomų nestabilumo kilmę 27,28,29,30. P53 reikalingas tinkamam centrosomų dubliavimui ir buvo įrodyta, kad jis lokalizuojasi centrosomose 31, 32, 33, 34. Norėdami nustatyti centrosomų aberacijas (& gt2 arba centrosomų nebuvimą), išanalizavome pieno navikų mitozines ląsteles, kad nesusidarytų centrosomų ir verpstės. Iš tiesų, mes stebėjome acentrosominius daugiapolius polinius velenus tik p53H/−ErbB2 navikuose (4f pav.).

Visi mūsų duomenys rodo, kad heterozigotiškumo atveju wtp53 leidžia išlaikyti vėžio ląstelių genomo vientisumą. It is plausible that DNA damage via stabilization of mutp53 protein shifts the balance between mutant and wtp53 alleles and unveils the oncogenic power of mutp53, leading to increased genomic aberrations and p53LOH. Consequently, loss of wtp53 allele leads to further genome perturbations fueling tumor progression.

P53LOH is associated with the activation of the mTOR pathway

The mTOR pathway is a key downstream component of ErbB2 signaling 35 . Indeed, specific inhibitors of ErbB2 (lapatinib and trastuzumab) effectively suppressed mTOR, as indicated by downregulation of pS6, a downstream target of mTOR, (Fig. 5a and Supplementary Figs. 4a and 5a). The mTOR pathway plays an essential role in regulating many oncogenic processes – such as genomic instability in different cancer types 18,36,37 , including breast cancer 36,38 . The stimulation of the mTOR pathway followed by translational deregulation and accelerated G1-S transition was implicated in inducing genomic instability and Apc LOH in a colon cancer mouse model 18 . Hence, we asked whether the increased genomic instability and elevated p53LOH observed in the presence of mutp53 (Fig. 2, Table 1) is attributed to increased mTOR signaling.

P53LOH is associated with the activation of the mTOR pathway. a ErbB2 inhibition by lapatinib and trastuzumab inhibits mTOR (pS6) in human mutp53 (BT474) cells. b The mTOR (pS6) pathway is more activated in mutp53ErbB2 (BT474 and SKBR3) than in wtp53 cells (ZR75–30). c Upregulation of wtp53 by nutlin suppresses mTOR signaling in wtp53ErbB2 cells ZR 75–30, but not in mutp53ErbB2 SKBR3 cells. d, e Irradiation induces RNA expression of p53 targets Sestrin 2 (d) and p21 (e) in all genotypes p53+/+ErbB2, p53−/+ErbB2 and p53H/+ErbB2 cells. QRT-PCR 24 h post-irradiation. n = 3 independent experiments. *p & lt 0,05 **p & lt 0,01 ***p & lt 0,001. f The mTOR (pS6) pathway is downregulated in the presence of wtp53 allele 24 h after irradiation that is concomitant with p21 upregulation. g irradiation-induced p53LOH in p53H/+ErbB2 cells is associated with upregulation of mTOR and lack of detectable p21 in the long term. This is in contrast to p53+/+ErbB2 and p53−/+ErbB2 cells. Western blot 7 days post-irradiation. HSC70 as a loading control. h Irradiation-induced p53LOH is concomitant with the upregulation of mTOR signaling that is more profound in mutp53 heterozygous tumors. The scale bar represents 50 μm. Hsp90 inhibition by ganetespib (i) and HSF1 inhibition by KRIBB11 (j) suppresses mTOR in mutp53 human BT474 cells. Western blot after 24 h treatment with indicated concentrations. GAPDH as a loading control. k p53LOH after irradiation is associated with both mTOR and HSF1 activation (as indicated by elevated Hsp70) only in p53H/+ErbB2 cells. Western blot 7 days after irradiation. HSC70 as a loading control. Error bars represent ± SD. Experiments were repeated three times with similar results.

Several studies showed that wtp53 inhibits the mTOR pathway via inducing Sestrin 1 and 2 expressions, that interact and activate AMPK leading to mTOR inhibition 39,40 . Our data show elevated mTOR signaling in mutp53ErbB2 vs. wtp53ErbB2 human cancer cells as indicated by high levels of downstream effectors of mTOR—p70S6 and pS6, whereas the level of mTOR and p-mTOR protein were comparable (Fig. 5b and Supplementary Figs. 4b and 5b). Furthermore, upregulation of wtp53 by nutlin suppressed mTOR signaling in wtp53ErbB2 cells, but not in mutp53ErbB2 cells (Fig. 5c and Supplementary Figs. 4c and 5c). Consistent with transcriptional activity of wtp53 (Fig. 2f), Sestrin 2 and p21 mRNA expression was upregulated 24 h post-irradiation in all mouse cell lines genotypes (Fig. 5d–e), and this upregulation was associated with downregulation of mTOR activity (Fig. 5f and Supplementary Fig. 5d). Importantly, irradiation did not alter pAKT, the upstream effector of mTOR, (Fig. 5f and Supplementary Fig. 5d), indicating that wtp53-mediated induction of Sestrins is the main regulator of mTOR activity post-irradiation.

To investigate the effect of p53LOH on mTOR activity, we tested cells 7 days post-irradiation (Fig. 2f). Compared to p53+/+ErbB2, the loss of wtp53 allele in p53H/+ErbB2 cells was associated with mTOR upregulation and p21 suppression (Fig. 5g and Supplementary Fig. 5e), while there were sustained mTOR inhibition and p21 upregulation in p53−/+ErbB2 cells (Fig. 5g). Similarly, irradiation in vivo exacerbated p53LOH concomitant with significant upregulation of mTOR signaling in p53H/+ErbB2 tumors (Fig. 5h and Supplementary Fig. 6a, b Table 1).

Next, we asked whether mutp53 impacts the mTOR pathway through a gain-of-function (GOF) mechanism. We previously showed that mutp53 amplifies ErbB2 signaling via stimulation of HSF1 and its transcriptional target Hsp90, which, in turn, stabilizes numerous Hsp90 clients, such as ErbB2 and mutp53 itself 41 . The mTOR pathway components, which are Hsp90 clients (https://www.picard.ch/downloads/Hsp90interactors.pdf), may also be stabilized by mutp53-HSF1-Hsp90 loop. Indeed, inhibition of both Hsp90 and HSF1, efficiently suppressed mTOR signaling in mutp53ErbB2 cell lines BT474 (Fig. 5I, j and Supplementary Fig. 6c, d) and SKBR3 (Supplementary Fig. 4a–c). Furthermore, p53LOH post-irradiation was associated with the activation of both mTOR and HSF1 (as indicated by its elevated target, Hsp70) only in p53H/+ErbB2 cells (Fig. 5k and Supplementary Fig. 6e). Hence, in addition to the loss of wtp53 suppressive activity, p53LOH may lead to mTOR activation via stimulation of HSF1-ErbB2 axis in a mutp53-dependent manner, providing the survival advantage over p53+/+ErbB2 and p53−/+ErbB2 cells. Thus, the activation of the mTOR pathway associated with p53LOH may generate selective pressure for the loss of wtp53 allele in p53H/+ErbB2 cells.

Cells with mutant p53 have defective DNA-damage repair response and cell-cycle profile following γ-irradiation

Upon genotoxic stress, wtp53 activates the transcription of genes involved in cell-cycle arrest and DNA repair or apoptosis, to protect the genome from the accumulation of mutations, while mutp53 may perturb these genome-guarding mechanisms and promote genomic instability 19,42 . Yet, how p53 heterozygous cells respond to DNA damage is not fully understood.

Hence, we irradiated (9 Gy) cultured mouse mammary tumor cells and examined the extent of DNA damage using γH2AX as a marker of DNA double-strand breaks. Western blot analysis (Fig. 6a, b and Supplementary Fig. 7) and foci assessment (Fig. 6c) showed sustained DNA damage up to 24 h in p53H/+ErbB2 cells. Conversely, in p53+/+ErbB2 cells, γH2AX peaked at 2 hr post-irradiation, was efficiently resolved by 4 h, and resumed to a normal level by 24 h post-irradiation (Fig. 6a, c and Supplementary Fig. 7). These results suggest that, while p53+/+ cells exhibit a functional DNA-damage response, wtp53 haploinsufficient cells manifest persistent DNA damage due to a deficient DNA repair following γ-irradiation.

Cells with mutant p53 have defect both in DNA-damage repair response and in cell-cycle profile following γ-irradiation (a, b) Western blot of γH2AX level (representing DNA damage) post-irradiation (9 Gy, single dose) showing γH2AX efficient resolution in p53+/+ErbB2 cells (a) but is sustained up to 24 h in p53H/+ErbB2 and p53−/+ErbB2 cells (b). HSC70 as a loading control. c Quantification of cells with >5 and <5 γH2AX foci/cell in p53+/+ErbB2, p53H/+ErbB2, and p53−/+ErbB2 cell lines, before and after γ-irradiation (9 Gy, 2 and 24 h post-irradiation). d Aberrant cell-cycle checkpoint following γ-irradiation in p53H/+ErbB2 cells. Bar graphs showing cell-cycle analysis of p53+/+ErbB2, p53H/+ErbB2, and p53−/+ErbB2 cell lines irradiated (gray bars) or not (black bars). e, f QRT-PCR 24 h post-irradiation is showing the impact of a single dose of γ-irradiation (9 Gy) on the transcription of Cyclin D1 (e), Cyclin E2 (f), Cyclin B (g). Level of transcripts was quantified relatively to HPRT. n = 3 independent experiments. *p & lt 0,05 **p & lt 0,01 ***p & lt 0,001. Error bars represent ± SD.

Next, we compared cell-cycle profiles of cells with various genotypes 24 h after γ-irradiation. Non-irradiated p53+/+ErbB2 and p53−/+ErbB2 cells exhibited comparable cell-cycle profiles, whereas p53H/+ErbB2 cells showed cell-cycle profile with lower G1 and S and significantly higher G2/M indicating an increased rate of proliferation (Fig. 6d). Consistent with fast recovery from DNA-damage post-irradiation, p53+/+ErbB2 cells did not significantly change G1 and S content and had a slight increase in G2/M arrest (Fig. 6d). In p53−/+ErbB2 cells, irradiation-induced G1 and G2/M arrest, and significantly reduced S-phase (Fig. 6d). Conversely, p53H/+ErbB2 cells continued cell cycling with sustained DNA damage (Fig. 6a, b), as indicated by the unchanged S-phase and increased G2/M (Fig. 6d).

We then evaluated the expression of cyclin D1, cyclin E, and cyclin B 24 h post-irradiation. Cyclin D1 is essential for G1-S progression 43,44,45 , and its level varies by cell-cycle phase 43,44,45 . At basal level all three cell lines had similar cyclin D1 transcription (Fig. 6e), though p53H/+ErbB2 cells tended to have a higher level (1.5-fold higher than p53+/+ErbB2) reflecting a higher overall proliferation. Consistent with unchanged S-phase post-irradiation, cyclin D1 transcription level remained unchanged in both p53+/+ErbB2 and p53H/+ErbB2 cell as compared to non-irradiated controls (Fig. 6e). However, p53−/+ErbB2 cells showed the highest increase in cyclin D1 transcription post-irradiation (Fig. 6d) consistent with G1 arrest and diminished S-phase.

Cyclin E prepares cells for DNA replication during the G1-S transition and is required for centrosome duplication in the S-phase 46 . While there was no significant difference in cyclin E2 transcription level in non-irradiated cell lines, both p53H/ + ErbB2 and p53−/+ErbB2 cells showed a significant reduction in cyclin E2 transcription post-irradiation. This result suggests that following DNA-damage wtp53 induces growth arrest in p53−/+ErbB2 cells, while this mechanism malfunctions in p53H/+ErbB2 cells, which enter S-phase unprepared for correct centrosome number and DNA duplication. Additionally, our results indicate that following DNA-damage cyclin E requires both wtp53 alleles, whereas p53 haploinsufficiency leads to inadequate cyclin E expression (Fig. 6f).

Cyclin B is required for mitotic spindle assembly and entry into mitosis 47 . There was no significant difference in cyclin B transcription level in non-irradiated cell lines (Fig. 6g). However, irradiation induced a significant cyclin B transcription reduction only in p53−/+ErbB2 cells, indicating a blockage in entering mitosis. In agreement with elevated G2/M-phase post-irradiation, cyclin B showed a marginal increase in p53H/+ErbB2 cells indicating a transition to mitosis with unrepaired DNA.

Hence, in p53H/+ErbB2 cells, the aberrant G1-S transition coupled with defective DNA repair may generate the genomic plasticity that facilitates p53LOH. In turn, p53LOH upregulates the mTOR pathway to further enhance cancer cells fitness and enable their survival after DNA damage.


Rezultatai

UVB treatment stimulates ROS production in sperm mitochondria

Mitochondria are the main cellular producers (and also targets) of ROS. In this study, we assessed the production of superoxide, the major form of ROS produced by the mitochondria, in human spermatozoa after UVB treatment. We observed that the number of spermatozoa labelled by Msox, which correspond to spermatozoa with higher ROS production, increased after 60 sec of exposure, reaching a maximum after 180 sec (Fig. 1).

UVB treatment affects sperm MMP

The mitochondrial proton gradient originates an electrochemical potential (∆p) resulting in a pH (∆pH) and in a voltage (∆ψm) gradient across the mitochondrial inner membrane (Newmeyer & Ferguson-Miller, 2003 ). The transmembrane electrical potential (∆ψ) is the main component of the electrochemical gradient, accounting for more than 90% of the total proton motive force (Moreira ir kt., 2005 ), and is thus crucial for good mitochondrial performance. Therefore, changes associated with ∆ψ are critically important in studies regarding mitochondrial function.

We observed that UVB irradiation caused a decrease in sperm MMP, that is, sperm population with high MMP mitochondria (red) decreased whereas sperm population with low MMP (green) increased. This effect was dependent on the time of exposure (Fig. 2), being significant at 120 sec and peaking at 180 sec. At this time (180 sec), the observed effect was similar to the one using the mitochondrial uncoupler CCCP, a substance that collapses MMP.

UVB treatment results in lipid peroxidation

DNA and sperm membranes are the most likely targets of oxidative stress-induced injury (Agarwal ir kt., 2003 Baker & Aitken, 2005 Tremellen, 2008 ). In fact, owing to the high proportion of unsaturated fatty acids and low levels of antioxidant defences, the sperm membrane is highly susceptible to peroxidation. As noted for ROS formation, we observed that lipid peroxidation increased significantly after 60 sec of UVB exposure peaking at 180 sec of exposure (Fig. 3), mirroring the effect described for UVB-ROS production.

Sperm viability

A decrease in sperm viability was evident after 120 sec of UVB exposure, reaching a minimum after 180 sec of UVB irradiation (Fig. 4). These results appear to be in agreement with those obtained for mitochondria functionality (using JC-1, Fig. 1) indicating that sperm viability and mitochondrial functionality are connected, a relationship further confirmed by the existence of a strong correlation between these two parameters (Table 1). In the same vein, sperm viability was shown to be negatively correlated with sperm ROS production and lipid peroxidation (Table 1).

Low MMP (JC-1 green) High superoxide production (MSox positive) Lipid peroxidation (BODIPY positive) Disrupted membrane (PI positive)
High MMP (JC-1 red) −0. 999*** Pearson correlation coefficients (r) obtained between all variables studied are presented, ***p ≤ 0.001.
−0.740*** Pearson correlation coefficients (r) obtained between all variables studied are presented, ***p ≤ 0.001.
−0.646*** Pearson correlation coefficients (r) obtained between all variables studied are presented, ***p ≤ 0.001.
−0.954*** Pearson correlation coefficients (r) obtained between all variables studied are presented, ***p ≤ 0.001.
Low MMP (JC-1 green) 0.555*** Pearson correlation coefficients (r) obtained between all variables studied are presented, ***p ≤ 0.001.
0.641*** Pearson correlation coefficients (r) obtained between all variables studied are presented, ***p ≤ 0.001.
0.948*** Pearson correlation coefficients (r) obtained between all variables studied are presented, ***p ≤ 0.001.
High superoxide production (MSox positive) 0.640*** Pearson correlation coefficients (r) obtained between all variables studied are presented, ***p ≤ 0.001.
0.844*** Pearson correlation coefficients (r) obtained between all variables studied are presented, ***p ≤ 0.001.
Lipid peroxidation (BODIPY positive) 0.604*** Pearson correlation coefficients (r) obtained between all variables studied are presented, ***p ≤ 0.001.
  • Pearson correlation coefficients (r) obtained between all variables studied are presented, ***p ≤ 0.001.


Effects of irradiation on food

Some foods, such as dairy foods and eggs, cannot be irradiated because it causes changes in flavour or texture. Fruits, vegetables, grain foods, spices and meats (such as chicken) can be irradiated.

Irradiation causes minimal changes to the chemical composition of the food, however, it can alter the nutrient content of some foods because it reduces the level of some of the B-group vitamins. This loss is similar to those that occur when food is cooked or preserved in more traditional and accepted ways, such as canning or blanching.


Išvados

We demonstrated that acute exposure to low-dose (0.1 Gy) γ-radiation could affect the functional characteristics of human BM-MSCs including their hematopoiesis-supportive capability and expansion. These changes were transient, and the characteristics of Ir-MSCs recovered such that they were similar to those of non-Ir-MSCs (Fig. 10). Further research incorporating larger numbers of samples is warranted.

Graphical summary. Acute exposure to low-dose γ-radiation (0.1 Gy) could affect the functional characteristics of human BM-MSCs at the early phase. However, these changes were transient and recovered at the late phase


The Effects of Laser Irradiation on Osteoblast and Osteosarcoma Cell Proliferation and Differentiation „Vitro“

Tikslas: The aim of this study was to investigate the effects of 670-nm, 780-nm, and 830-nm laser irradiation on cell proliferation of normal primary osteoblast (MC3T3) and malignant osteosarcoma (MG63) cell lines in vitro. Fonas: Some studies have shown that laser phototherapy is able to stimulate the osteogenesis of bone tissue, increasing osteoblast proliferation and accelerating fracture consolidation. It has been suggested that laser light may have a biostimulatory effect on tumor cells. However, the mechanism by which the laser acts on cells is not fully understood. Materials and Methods: Neonatal, murine, calvarial, osteoblastic, and human osteosarcoma cell lines were studied. A single laser irradiation was performed at three different wavelengths, at the energies of 0.5, 1, 5, and 10 J/cm 2 . Twenty-four hours after laser irradiation, cell proliferation and alkaline phosphatase assays were assessed. Rezultatai: Osteoblast proliferation increased significantly after 830-nm laser irradiation (at 10 J/cm 2 ) but decreased after 780-nm laser irradiation (at 1, 5, and 10 J/cm 2 ). Osteosarcoma cell proliferation increased significantly after 670-nm (at 5 J/cm 2 ) and 780-nm laser irradiation (at 1, 5, and 10 J/cm 2 ), but not after 830-nm laser irradiation. Alkaline phosphatase (ALP) activity in the osteoblast line was increased after 830-nm laser irradiation at 10 J/cm 2 , whereas ALP activity in the osteosarcoma line was not altered, regardless of laser wavelength or intensity. Išvada: Based on the conditions of this study, we conclude that each cell line responds differently to specific wavelength and dose combinations. Further investigations are required to investigate the physiological mechanisms responsible for the contrasting outcomes obtained when using laser irradiation on cultured normal and malignant bone cells.


Įvadas

In modern society people are frequently exposed to different types of radiations and this exposure comes form different sources. It could be either related to everyday life (e.g. televisions, mobile phones, computer devices, occupational equipment) or to the necessity of medical care (e.g. diagnostic imaging, interventional radiology procedures, anticancer therapy). Usually radiations are divided into two big subgroups, ionizing and non-ionizing, depending on the energy of the radiated particles.

Non-ionizing radiations

These type of radiations are basically electromagnetic fields (EMFs) that do not have enough energy to release electrons (non–ionizing), but are able to excite the movement of an electron to a higher energy state. Several classification of EMFs have been proposed, but generally 4 big subgroups are recognized [1, 2]:

extremely low frequency EMFs that have frequencies below 300 Hz (military equipment, railroads)

intermediate frequency EMFs characterized by frequencies ranging from 300 Hz to 10 MHz (televisions, computer monitors, industrial cables)

hyper frequency EMFs characterized by frequencies ranging from 10 MHz to 3000 GHz (mobile phones, radio)

static EMFs that have zero frequency (MRI, geomagnetism)

The biological reaction of the human body to EMFs is still open to discussion, given the fact that many factors can influence the degree to which people may be affected (gender, body mass index, bone density, period of life, frequency and duration of the exposure) [3, 4]. EMFs have a high penetration power that could have disastrous consequences on tissues characterized by high concentrations of ions and electrons. Essentially the effects of non-ionizing radiations can be divided into thermal effects, caused by the heat generated by EMFs on a specific area, and non thermal effects, related to the absorption of the energy of the radiation [5]. Several studies have been published about the cytotoxicity of non-ionizing radiations, but most of them are based on animal models (rats) or on cell line cultures (fibroblasts, melanocytes, lymphocytes, monocytes, muscular cells) [6]. Concerning their effect on the female genital system, different studies on mice have shown that EMFs are able to prevent the formation of antral follicle [7], to inhibit ovulation and to reduce the total number of corpora lutea [8] and given their capacity to extend the lifetime of free radicals they favor cell apoptosis by increasing the oxidative stress resulting in DNA damage [9]. Some authors also observed that mice exposed to non-ionizing radiation have an increased number of macrophages in granulosa cells and lipid drops in theca cells [10]. Combined with the fact that an elevated number of macrophages has also been found in rats’ growing follicles and corpora lutea, some authors postulate that EMFs exposure could accelerate apoptosis in ovarian cortical tissue (responsible for oocytes degeneration) [11]. Some studies conducted on pregnant women have focused on the effect of occupational exposure to video display terminals and pregnancy outcome: an elevated abortion rate and an increased number of birth defects have been found [12, 13]. However, these results need to be carefully considered, because controversial conclusions have been obtained on animal models [14].

Ionizing radiations

These are high energy radiations that are capable to knock electrons off an electron shell leaving the atoms with a net positive charge (ionization). The biological consequence on human cells of this electron strip is direct or indirect damage of cell’s DNA. In case of a direct damage, the displaced electron breaks the DNA strand, where in case of an indirect damage the electron reacts with a water molecule resulting in the creation of free radicals that in the end damage the cell’s DNA. A double-strand DNA break allows the potential for incorrect DNA repair leading to cell death or for symmetrical translocation, which could lead to the expression of an oncogene during cell replication or to abnormal division in gonads with potential hereditary disorders. The effects of ionizing radiations can be divided into two types:

deterministic effects, which are dose-dependent. They take place only once the threshold has been exceeded and cause a functional impairment of a tissue/organ (e.g. impaired fertility related to altered ovarian function)

stochastic effects, which are the result of symmetrical translocation during cell replication. In this case there is no threshold level, but the odds of a stochastic effect to occur increases linearly with the dose (linear no-threshold hypothesis).

Charged particles, X-rays and gamma-rays represent ionizing radiations commonly used in medical care (diagnostic imaging and procedures, radiotherapy).

Given the extent of the topic, this review is focused on the most relevant clinical effects of radiotherapy on female fertility and on possible options for fertility preservation in young cancer survivors.


5 Conclusion

Irradiation doses from 4.5 to 16 Gy reduced the neural progenitor pool irreversibly, possibly by a combinatorial effect of proliferation inhibition, cell death induction, and aberrant differentiation. As dose and age of the ex vivo hippocampal slice culture model correspond to a “hippocampal sparing” therapeutic irradiation in infantile patients, these results underline that additional measures are necessary to prevent radiation-induced adverse effects on neurogenesis in tumor patients. Resveratrol was able to reduce the irradiation-induced decline of progenitor cells warranting further investigations to verify its neuroprotective potential in vivo.