Informacija

Kaip sujungti duomenų taškus iš skirtingų „Western blot“ į vieną diagramą?


Aš atlieku „Western blot“ duomenų analizę ir turiu dviejų skirtingų „Western blot“ duomenų. Dviejuose Western blot'uose aš pažymėjau tuos pačius baltymus. Aš lyginu išmušimo (KO) mėginius su laukinio tipo (WT) mėginiais savo Western blot. Aš kuriu grafikus, rodančius dominančio baltymo lygio pokyčius mano KO mėginiuose, palyginti su mano WT mėginiais.

Aš tai darau pirmiausia norėdamas gauti normalizuotą integruotą baltymų juostų tankį. Studijuoju neaktyvią fosfoproteinų formą. Norėdami gauti normalizuotą integruotą tankį, dalinu integruotą neaktyvių baltymų juostos tankį iš integruoto visos baltymų juostos tankio.

Pirmoje dėmėje turiu 2 WT/KO poras ir analizuoju kiekvienos poros raukšlių pasikeitimą. Antrame blote turiu techninį šių dviejų porų pakartojimą.

Aš dalinu normalizuotą integruotą WT juostos tankį kiekvienoje poroje taip, kad reikšmė būtų 1. Tada kiekvienai porai aš dalinu normalizuotą integruotą KO juostos tankį iš normalizuoto WT juostos tankio. Šios vertės lyginamos su pradine 1, kad būtų gautas kartotinis pokytis.

Noriu antrojo bloko techninius pakartojimus įdėti į tą pačią diagramą su pirmojo bloko duomenų taškais, kad galėčiau juos palyginti. Tačiau norėčiau žinoti, kai nubrėžiate savo baltymų juostas, kad apskaičiuotumėte jų integruotą tankį, ar jos turi būti tos pačios srities tarp 2 dėmių?

Pavyzdžiui, mano pirmojoje dėmėje neaktyvių baltymų juostų kontūrai yra vienodi. Antrame mano blote neaktyvių baltymų juostos kontūrai yra vienodi, tačiau plotas skiriasi, palyginti su pirmuoju bloku.

Panašiai, mano visų baltymų juostų atveju, pirmojoje dėmėje juostos kontūrų sritys yra vienodos, tačiau jos skiriasi nuo juostos sričių antrame blote.

Jei noriu sujungti savo duomenų taškus iš abiejų dėmių į vieną grafiką, ar mano neaktyvių baltymų ir viso baltymo juostų sritys turi būti vienodos abiejuose blotuose, kad analizė būtų teisinga? O gal tai nebūtina?

Bet kokios įžvalgos yra vertinamos.


Kadangi nepateikėte jokio atkartojamo pavyzdžio, aš tiesiog pateikiu aukščiau parašytą pavyzdį. Peržiūrėkite dokumentus atlikdami? Pdf ir? Dev.off ()

Keli sklypai būtų (pridedami prie „Jilber“)

arba Galite naudoti paketą „plyr“, kad sukurtumėte pdf su keliais brėžiniais

buvo df yra duomenų rėmas, kuriame yra sąlyginis koeficientas (z) ir tikslinis kintamasis (y). Gausite tiek plotų, kiek z lygių, visi įtraukti į pdf ataskaitą.

Pirmiau pateikti atsakymai padės eksportuoti lentelės brėžinius, bet jei norite, kad jie būtų lentelėje, kaip 2–3 grafikai 1 eilutėje, galite naudoti šį kodą:


Įrankiai, padedantys aptikti sukčiavimą „The Office of Research Integrity“ (ORI)

Mokslinių tyrimų sąžiningumo tarnyba (ORI) yra atsakinga už tyrimų, susijusių su įtarimais dėl netinkamo tyrimo, susijusius su tyrimais, kuriuos bent iš dalies finansuoja JAV m. Visuomenės sveikatos tarnybos agentūros, finansavimą.

Pasak ORI direktoriaus pavaduotojo, mokslų daktaro Johno Dahlbergo, priežiūros apžvalga iš esmės yra institucinių įrašų ir rezultatų apžvalga, kurią atlieka dešimties plataus spektro mokslininkų ir gydytojų tyrėjų ORI ir rsquos skyrius (DIO). disciplinos pagrindų.

Jis sakė: & ldquoTempis, kuriuo jų prašoma ištirti tyrimus, labai didėja. Per daugelį metų DIO darbuotojai sukūrė daugybę kompiuterinių metodų, skirtų duomenims ir kitiems tyrimų įrašams tirti, kad sustiprintų netinkamo tyrimo elgesio įrodymus tais atvejais, kai išvados atrodo pagrįstos. & Rdquo

Čia daktaras Dahlbergas supažindina mus su kai kuriomis priemonėmis ir procesais, kurių daugelis yra prieinami visuomenei, ir dalijasi naudingais komandos patarimais.


3. PCA biplot = PCA balų grafikas + pakrovimo grafikas

3 pav. PCA biplotas

Tikriausiai pastebite, kad PCA biplot paprasčiausiai sujungia įprastą PCA grafiką su apkrovų grafiku. Išdėstymas yra toks:

  • Apatinė ašis: PC1 balas.
  • Kairioji ašis: PC2 balas.
  • Viršutinė ašis: apkrovos PC1.
  • Dešinė ašis: apkrovos PC2.

Kitaip tariant, kairioji ir apatinė ašys yra PCA grafikas - naudokite jas, norėdami perskaityti mėginių (taškų) PCA balus. Viršutinė ir dešinė ašys priklauso pakrovimo schemai - naudokite jas, kad sužinotumėte, kaip stipriai kiekviena charakteristika (vektorius) veikia pagrindinius komponentus.


Techniniai sumetimai

Antikūnų atskiedimas

Vienas iš labiausiai paveikiančių techninių veiksnių atliekant Western blot tyrimą yra antikūnų skiedimo optimizavimas. Daugelis veiksnių gali turėti įtakos norimam antikūnų atskiedimui, įskaitant turimų antikūnų kiekį, antikūnų specifiškumą antigenui, baltymų gausą ir turimų substratų pasirinkimą. Be to, individualūs laboratoriniai protokolai gali nukreipti tyrėjus į pageidaujamas, anksčiau optimizuotas sąlygas. Antikūno optimizavimas yra labai svarbus žingsnis siekiant užtikrinti tinkamą signalą triukšmui. Pirminis antikūnas, būdingas tiksliniam antigenui, jungiasi prie turimų baltymų epitopo vietų. Po kelių plovimo etapų, padedančių pašalinti nesusietą pirminį antikūną, antrinis antikūnas, konjuguotas su fermentu, tokiu kaip HRP, inkubuojamas ir prisijungia prie pirminio antikūno. Keli antriniai antikūnai gali prisijungti prie vieno pirminio antikūno, o tai sukelia amplifikacijos procesą, kurio metu daugiau šviesą gaminančių etikečių gali reaguoti ir gaminti didesnį aptikimą. Per didelis pirminių ar antrinių antikūnų kiekis gali sukelti per didelį dėmių prisotinimą arba per didelį foninį triukšmą. Be to, per didelis antikūnų kiekis gali sukelti greitą signalo susidarymą, o vėliau irimą - gali būti, kad signalas greitai išnyks, kol bus galima užfiksuoti signalą ant plėvelės ar naudojant vaizdo gavimo sistemą. Dėl šių problemų labai sunku tinkamai analizuoti ir padaryti išvadas iš eksperimento. Žemiau esančioje lentelėje gali būti pateiktos bendros gairės dėl antikūnų skiedimo, atsižvelgiant į baltymų tikslą ar mėginio gausą, antikūnų sąlygas ir pasirinktą substratą. Taip pat svarbu pažymėti, kad pereinant nuo vieno substrato prie kito, gali tekti iš naujo optimizuoti antikūnų skiedimą, remiantis pardavėjo rekomendacijomis.

Antikūnų skiedimo rekomendacijos

Sąlygos
PavyzdysAntigenasAntikūnasRekomenduojamas substratasPirminisAntrinisSpecialios pastabos
Pavyzdys yra gaususAntigeno gausuAntikūnų kokybė gera„SuperSignal West Pico PLUS“1: 1K1: 100 tūkst
Pavyzdys yra gaususAntigenas yra daug nežinomasAntikūnų kokybė nežinoma„SuperSignal West Pico PLUS“1: 1K1: 100 tūkstJei juostų nematyti, dėmę galima nuplauti ir iš naujo nufotografuoti naudojant „Atto“
Pavyzdys yra gaususAntigenų gausa yra mažaAntikūnų kokybė prasta„SuperSignal West Atto“ substratas1: 1K1: 100 tūkst
Pavyzdys yra gaususAntigenų gausa yra mažaAntikūnų kokybė gera„SuperSignal West Atto“ substratas1: 2K1: 250 tūkstManoma, kad įprastas pirminis naudojimas yra 1: 1K
Pavyzdys yra gaususAntigenų gausa yra mažaAntikūnų kiekis ribotas„SuperSignal West Atto“ substratas1: 5K1: 100 tūkstManoma, kad įprastas pirminis naudojimas yra 1: 1K
Pavyzdys yra gaususAntigeno gausuAntikūnų kiekis ribotas„SuperSignal West Atto“ substratas1: 20 tūkst1: 250 tūkstManoma, kad įprastas pirminis naudojimas yra 1: 1K
Pavyzdys yra ribotasAntigeno gausuAntikūnų kokybė gera„SuperSignal West Pico PLUS“1: 1K1: 100 tūkstArba galima įkrauti mažiau ir naudoti Atto esant vienodoms antikūnų koncentracijoms
Pavyzdys yra ribotasAntigenų gausa nežinomaAntikūnų kokybė nežinoma„SuperSignal West Pico PLUS“1: 1K1: 100 tūkstJei juostų nematyti, dėmę galima nuplauti ir iš naujo nufotografuoti naudojant „Atto“
Pavyzdys yra ribotasAntigenų gausa yra mažaAntikūnų kokybė gera„SuperSignal West Atto“ substratas1: 1K1: 250 tūkst
Pavyzdys yra ribotasAntigenų gausa yra mažaAntikūnų kokybė prasta„SuperSignal West Atto“ substratas1: 1K1: 100 tūkst
*Remiantis 1 mg/ml antikūnų koncentracija

Signalo fiksavimas

Western blotting yra galinga, įprasta programa, tačiau chemiliuminescencinio signalo fiksavimas gali būti sudėtingas, nes Western blotting apima daugybę veiksmų, kuriems atlikti reikia tam tikrų įgūdžių. Nepavyko užfiksuoti signalo gali sukelti daug veiksnių. Su tiek kintamųjų (2 lentelė), problemos dėmės šalinimą galima prilyginti „adatos šieno kupetoje“ paieškai. Tradicinis protokolas dažnai yra neveiksmingas nustatant konkretų baltymą. Todėl, norint optimizuoti rezultatus, dažnai reikalingi trikčių šalinimo vadovai. Norėdami pamatyti veiksnių, turinčių įtakos „Western blot“ rezultatams, apžvalgą. 2 lentelė. Norėdami gauti informacijos apie „Western blot“ trikčių šalinimą, apsilankykite „Western Blot“ - trikčių šalinimas.

2 lentelė. Veiksniai, turintys įtakos Western blotting rezultatams.

FaktoriusKintama charakteristikaGreiti patarimai
Tikslinis antigenasKonformacija, stabilumas, turimas (-i) epitopas (-ai)
Poliakrilamido gelisGamintojas, procentas poliakrilamido, amžius, partijaNaudokite Bis-Tris gelius, skirtus mažai/vidutiniškai gausiems baltymams, naudokite Tris-glicino gelius, kad gautumėte daug baltymų, Tricine gelius, skirtus mažos molekulinės masės baltymams, ir Tris-acetato gelius, skirtus didelės molekulinės masės baltymams
MembranaGamintojas, tipas, partija
Pirminis antikūnasSpecifiškumas, titras, giminingumas, inkubacijos laikas ir temperatūraNaudokite antikūnus, specialiai patvirtintus Western blotting
HRP konjugatasFermentų aktyvinimo lygis ir aktyvumas, šaltinis gyvūnas, koncentracija, ploviklis
Blokuojantis buferisTipas, koncentracija, kryžminis reaktyvumas
SkalbiaBuferis, tūris, trukmė, dažnisPrieš įdėdami substratą, plaukite mažiausiai 6x 5 minutes, kad gerai pašalintumėte nesusijusius antrinius antikūnus
SubstratasJautrumas, gamintojo partija, amžius
Aptikimo metodasFilmo amžius, vaizdo instrumentų gamintojas, ekspozicijos laikas

Signalo intensyvumas ir trukmė

Esant optimalioms Western blotting sąlygoms, chemiliuminescencinis signalas gali trukti 6–24 val. Šviesos generavimo lygis ir trukmė priklauso nuo konkretaus naudojamo substrato ir fermento ir substrato santykio sistemoje. Nors substrato kiekis dėmėje yra gana pastovus, fermento kiekis priklauso nuo pridėto kiekio ir kitų veiksnių (2 lentelė). Per daug fermentų konjugato, pritaikyto „Western blot“ sistemai, yra viena didžiausių signalo kintamumo, tamsaus fono, trumpos signalo trukmės ir mažo jautrumo priežasčių. Pageidautina signalo skleidimo kreivė, kuri lėtai mažėja (žr. Paveikslėlį žemiau), nes ji parodo, kad kiekvienas sistemos komponentas yra optimizuotas ir leidžia atkurti rezultatus. Per greitai gendantis signalas gali sukelti kintamumą, mažą jautrumą, didelį foną ir problemų su signalo dokumentacija. Ilgai trunkantis signalas sumažina rezultatų kintamumą dėl perdavimo efektyvumo, skirtingų gamintojų substrato ir kitų veiksnių. Dėl HRP molekulių oksidacijos reakcijos su luminoliu substrate, be gaminamos šviesos, susidaro laisvieji radikalai. Gausus HRP kiekis sistemoje sukuria laisvųjų radikalų gausą ir pagreitina HRP inaktyvavimo tikimybę. Laisvieji radikalai taip pat gali pažeisti antigeną, antikūnus ir membraną, todėl sumažėja pakartotinio zondavimo veiksmingumas. Žemiau esančiame paveikslėlyje pateikiamas signalo emisijos kreivių pavyzdys, sukurtas naudojant trumpalaikius ir ilgalaikius substratus.

Trumpos ir ilgos trukmės substratų signalo emisijos kreivių palyginimas. Kai „Western blot“ sistemoje yra fermento, signalo išvestis pasiekia aukščiausią lygį netrukus po substrato užtepimo ir greitai išsekina substratą (1 signalas). Optimalioje sistemoje signalo spinduliavimas pasiekia aukščiausią tašką maždaug po 5 minučių po substrato ir plokščių užtepimo kelias valandas (2 signalas).

Tiesioginiai ir netiesioginiai metodai

Tiesioginiam aptikimui naudojamas pažymėtas pirminis antikūnas. Kadangi inkubacija su antriniu antikūnu pašalinama, ši strategija užima mažiau laiko nei klasikinis Western blot. Be to, pašalinamas foninis signalas dėl kryžminio reaktyvumo su antriniu antikūnu. Tiesioginis aptikimas taip pat leidžia vienu metu aptikti kelis taikinius. Tačiau pirminio antikūno žymėjimas kartais neigiamai veikia jo imunoreaktyvumą ir neleidžia stiprinti signalo. Kadangi tiesioginis metodas paprastai yra mažiau jautrus nei netiesioginis aptikimas, jis yra naudingiausias, kai taikinio yra gana daug. Viena iš galimybių yra pirminio antikūno biotinilinimas, kuris yra netiesioginis metodas, kuris sustiprina signalą ir pašalina antrinio antikūno poreikį. Ženklinant biotinilinimo reagentais paprastai gaunama daugiau nei viena biotino dalis vienoje antikūno molekulėje. Kiekvienas biotino fragmentas gali sąveikauti su fermentais konjuguotu avidinu, streptavidinu arba „Thermo Scientific NeutrAvidin“ baltymu (kat. Nr. 31000). Iš esmės biotiną surišantis konjugatas pakeičia antrinį antikūną, o jo tinkama molinė koncentracija yra tokia pati, kaip ir naudojant antrinį antikūną. Mažas biotinilinimo reagentų dydis (paprastai mažesnis nei 2 kDa), lyginant su fermentais (40 kDa, kai HRP yra 140 kDa, AP), dažnai sumažina sterines kliūtis ir leidžia geriau pažymėtam pirminiam antikūnui veikti.

Tiesioginis ir netiesioginis baltymų aptikimas ir signalo stiprinimas formuojant avidino-biotino kompleksą tyrime, apimančiame nustatymą naudojant specifinius antikūnus (pvz., Imuninį tyrimą).

Tolimųjų vakarų metodai

Kartais antikūno prieš specifinį antigeną nėra arba jis netinka Western blot analizei. Tikslinis baltymo specifinis aptikimas blotinimo būdu yra įmanomas, jei yra tinkamas surišimo partneris, kurį galima naudoti kaip zondą. Šio tipo taikymas, vadinamas tolimųjų vakarų dėmėmis, paprastai naudojamas baltymų ir baltymų sąveikai atrasti arba patvirtinti. Yra daug Western blotting aptikimo variantų, apimančių, bet neapsiribojant, anksčiau minėtas strategijas. Tolimųjų vakarų blotavimo metu pažymėti surišimo partneriai gali būti pažymėti an in vitro vertimo reakcija su 35S pažymėtu zondu. Taip pat galima zondą biotinilinti ir aptikti su biotiną surišančiu baltymų konjugatu. Šio tipo aptikimas turi papildomą signalo stiprinimo pranašumą. Tačiau, naudojant šią techniką, zondas neturėtų būti žymimas per daug, kad būtų išvengta tikslo aptikimo. Be to, rekombinantinis zondas gali būti ekspresuojamas bakterijose, turinčiose žymę, tokią kaip GST, HA, c-Myc arba FLAG, kuriose aptikimas atliekamas per pažymėtą antikūną prieš tam tikrą žymą. Kaip ir kitos blotinimo programos, tolimųjų vakarų metodas yra veiksmingas tiek membranos, tiek gelio aptikimo sistemoms. Žemiau pateiktoje schemoje pateikiama tolimųjų vakarų darbo eiga.

Tolimųjų Vakarų bloto diagrama, skirta baltymų ir baltymų sąveikai analizuoti. Šiame pavyzdyje pažymėtas jauko baltymas naudojamas zonduoti arba pernešimo membraną, arba gelio grobio baltymą. Sujungus, fermentu (krienų peroksidazės HRP) konjuguotas antikūnas, nukreiptas į masalo žymę, naudojamas sąveikai žymėti, kuri tada aptinkama naudojant fermentinę chemiliuminescenciją. Šį bendrą metodą galima koreguoti, kaip parodyta žemiau esančioje lentelėje, naudojant nepažymėtą jauko baltymą, kurį aptinka antikūnas, biotinilintą masalo baltymą, kuris aptinkamas fermentais konjuguotu streptavidinu, arba radioaktyviai pažymėtą masalo baltymą, kuris aptinkamas veikiant plėvele.


1 Laemmli vietoj LDS mėginio buferio galima naudoti su atitinkamais veikimo ir perkėlimo buferiais. Elektroforezę galima atlikti redukuojančiomis ir nesumažinančiomis sąlygomis.

2 Pasirinkite elektroforezės ir baltymų perkėlimo aparato tipą pagal savo gelių dydį (pvz., Mini-, midi- arba maxi-geliai).

3 Šis protokolas gali būti pritaikytas bet kokio dydžio, sudėties, dydžio geliams ir bet kokiam šulinėlių skaičiui.

4 Jei pageidaujate, taip pat galima naudoti PVDF arba nailono membranas.

5 Įkraunami mėginiai gali būti skirtingi arba pasikartojantys.

6 Lentelė skirta sekti žymenų migracijos statistiką pasirinkto procento gelyje. Be to, pagal naudojamas žymeklio rūšis galima sukurti skirtingas lenteles. Statistika reikalinga tolesnėms daugiapakopėms „Western blot“ procedūroms, jei reikia išpjauti gelio juostelę su dominančiu baltymu (žinomu molekuliniu svoriu), tačiau nebuvo įterptas iš anksto pažymėtas žymeklis.

7 Jei dominantis baltymas migruoja žymeklio apibrėžtų zonų sankirtoje (pvz., 100 kDa GAB1, kuris migruoja tarp zonų ➁ ir ➂ 25 kDa Grb2, kuris migruoja tarp zonų ➅ ir ➆ 74 kDa c -Raf, kuris migruoja labai arti zonos ➂ ir kt.), pjovimo plotas turi apimti abi zonas arba bent jau būti platesnis. Pvz., Shc baltymas turi tris 46 kDa, 52 kDa ir 66 kDa izoformas, migruojančias zonose ➃ ir ➄, todėl jį galima atskirti nuo zonoje esančių baltymų (pvz., P85, a PI3K reguliavimo subvienetas) ir tarp zonų ➅ ir ➆ (pvz., GRB2), supjaustant gelį į tris 9, 22, 38 ir 49 mm juostas (pamatyti 1 lentelė).

8 Maksimalus gelio juostelių, kurias galima sujungti į vieną AFP, skaičius priklauso nuo bendro perdavimo įrenginio matmens, taigi ir nuo AFP dydžio (aukščio ir pločio). Įprastai mes naudojame 7 × 10 cm filtrą, kuris suteikia daugiausiai dvylika gelio juostelių, kurių kiekvieno aukštis yra 0,6 cm. Tačiau reguliariai dedame mažiau gelio juostelių (pvz., Šešias), ypač kai jos yra platesnės ir (arba) membrana turėtų būti supjaustyta į dvi ar daugiau dalių po elektroforezinio baltymų perdavimo.

9 Jei įvyksta tam tikros pauzės, reguliariai sudrėkinkite gelio juostelių paviršių, lašindami dejonizuotą vandenį.

10 Arba visą nitroceliuliozės membranos gabalėlį galima apdoroti blokuojančiu reagentu ir tada inkubuoti su pirminių antikūnų mišiniu (įsitikinkite, kad jie nesikeičia) viename inde.

11 Pagalvėlės turi pakilti mažiausiai 0,5 cm virš katodo šerdies krašto. Jei ne, į baką įdėkite papildomą kempinės pagalvėlės filtravimo popierių.

Pirminius antikūnus galima surinkti į mėgintuvėlį ir kelis kartus pakartotinai panaudoti, jei jie papildyti 0,1% natrio azidu. Jei susidaro nuosėdos, filtruokite tirpalą per 0,22 ir#x003bcm filtrų bloką.

Chemiliuminescencinis signalas gali būti vizualizuojamas kitu vaizdavimo prietaisu ir kiekybiškai įvertinamas naudojant atitinkamą programinę įrangą. Arba signalas gali būti užfiksuotas ant plėvelės, po to atliekamas densitometrinis kiekybinis nustatymas.


MCAT biologijos praktikos klausimai (savarankiškas)

1. Mokslininkai tiria galimą naują onkoproteiną, susijusį su skrandžio vėžiu. RT-qPCR rezultatai rodo naujo baltymo mRNR transkriptų reguliavimą. Kuris iš šių yra galimas baltymų transkripcijos reguliavimo mechanizmas?

A) Chromatino struktūros atidarymas

C) Padidėjusi ribosomų sintezė

D) Padidėjęs amino rūgščių prieinamumas

2. Raudona gėlė suporuojama su balta gėle, todėl gaunami rausvi palikuonys. Tai pavyzdys:

3. Ne diabetu sergantis asmuo valgo didelį, angliavandenių turtingą patiekalą. Kuris iš šių glikolizės fermentų greičiausiai reguliuoja insuliną?

A) Fosfogliukozės izomerazė

4. Ląstelės gydomos vaistu, kuris išsklaido protonų gradientą per vidinę mitochondrijų membraną. Koks yra grynasis rezultatas?

A) Sustabdomas vėžio progresavimas

B) ATP negalima gaminti per ATP sintazę

C) Ląstelė naudos egzocitozę, kad pašalintų nefunkcines mitochondrijas

D) Ląstelės greitai sukurs naują ATP sintezės mechanizmą

5. Po virusinės infekcijos pacientas nerodo jokių kvėpavimo takų simptomų ar karščiavimo. Kuriame cikle labiausiai tikėtinas virusas?

Atsakymo raktas į savarankiškus praktikos klausimus

1. A pasirinkimas teisingas. Chromatino struktūros atidarymas leidžia transkripcijos faktoriams lengviau pasiekti DNR, todėl padidėja transkripcija, kuri sukuria mRNR transkriptus. Histono deacetilinimas lemia chromatino struktūros uždarymą (pasirinkimas B neteisingas). Ribosomų sintezė ir aminorūgščių prieinamumas gali rodyti padidėjusį baltymų transliaciją, o ne transkripciją (C ir D pasirinkimai neteisingi).

2. D pasirinkimas teisingas. Neišsamus dominavimas apibūdina dviejų fenotipų „susimaišymą“, o tai atsitinka, kai raudona ir balta gėlė susiporuoja, kad susidarytų rožinė (tarpinis fenotipas). Bendras dominavimas apibūdina abu rodomus fenotipus, o tai reikštų, kad dukteriniai palikuonys turi ir raudonos, ir baltos dėmės (A pasirinkimas neteisingas). Visiškas dominavimas apibūdina įprastą dominavimą, kuris šiuo atveju būtų raudonos gėlės, jei raudonos gėlės yra dominuojančios (pasirinkimas C neteisingas). Heterodominancija yra išgalvotas terminas (pasirinkimas B neteisingas).

3. B pasirinkimas teisingas. Fosfofruktokinazė-1 (PFK-1) yra negrįžtamas fermentas, o tai reiškia, kad jis yra svarbus taškas reguliuojant srautą arba srautą glikolizės būdu. Suvalgius didelį patiekalą, insulinas gali sureguliuoti PFK-1 aktyvumą keliais etapais, kad glikolizė vyktų greičiau. Atsakymų pasirinkimai A, C ir D yra grįžtami fermentai, todėl jie nėra geri reguliavimo taškai ir nėra naudojami kaip srauto per kelią kontrolės taškai.

4. B pasirinkimas teisingas. Protonų gradientas generuojamas taip, kad protonai iš tarpmembraninės erdvės patektų į matricą pagal jų cheminį gradientą. Protonų praėjimas per vidinę mitochondrijų membraną leidžia ATP sintezei gauti reikiamą energiją ATP gamybai. Klausimo kamienas nenagrinėja vėžio progresavimo (pasirinkimas A neteisingas). Kai ląstelės nustoja veikti, jos neatsikratys mitochondrijų, ir greičiausiai jos greitai nesukurs naujo ATP sintezės mechanizmo, nes pirmasis greičiausiai užtruko milijonus metų (pasirinkimai C ir D yra neteisingi) .

5. B pasirinkimas teisingas. Lizogeninis ciklas yra tas, kai virusas integruoja savo genomą į šeimininko genomą, tačiau jis dar nelizuoja ląstelės ir nesukuria daug palikuonių. Dėl to imuninė sistema gali jo nepastebėti. Lytinis ciklas įvyksta, kai virusas pradeda gaminti palikuonis ir lizuoja šeimininko ląsteles (A pasirinkimas neteisingas). Invazija ir baltymų gamyba apibūdina procesus, kuriuos virusas gali naudoti, tačiau jie nėra tikri ciklai (pasirinkimai C ir D yra neteisingi).


Turinys

Išraiškos profiliavimas yra logiškas kitas žingsnis po genomo sekos nustatymo: seka nurodo, ką ląstelė galėtų padaryti, o išraiškos profilis nurodo, ką ji iš tikrųjų daro tam tikru momentu. Genuose yra instrukcijos, kaip sukurti pasiuntinį RNR (mRNR), tačiau bet kurią akimirką kiekviena ląstelė gamina mRNR tik iš dalies nešiojamų genų. Jei mRNR gamybai naudojamas genas, jis laikomas „įjungtu“, kitaip - „išjungtu“. Daugelis veiksnių lemia, ar genas yra įjungtas ar išjungtas, pavyzdžiui, paros metas, ar ląstelė aktyviai dalijasi, ar ne, jos vietinė aplinka ir kitų ląstelių cheminiai signalai. Pavyzdžiui, odos ląstelės, kepenų ląstelės ir nervų ląstelės įjungia (išreiškia) šiek tiek skirtingus genus, ir tai iš esmės daro juos skirtingus. Todėl išraiškos profilis leidžia nustatyti ląstelės tipą, būseną, aplinką ir pan.

Išraiškos profiliavimo eksperimentai dažnai apima santykinio mRNR kiekio, išreikšto dviem ar daugiau eksperimentinių sąlygų, matavimą. Taip yra todėl, kad pasikeitę tam tikros mRNR sekos lygiai rodo pasikeitusį mRNR koduoto baltymo poreikį, galbūt tai rodo homeostatinį atsaką ar patologinę būklę. Pavyzdžiui, didesnis alkoholio dehidrogenazę koduojančios mRNR kiekis rodo, kad tiriamos ląstelės ar audiniai reaguoja į padidėjusį etanolio kiekį jų aplinkoje. Panašiai, jei krūties vėžio ląstelės išreiškia didesnį mRNR kiekį, susijusį su tam tikru transmembraniniu receptoriumi, nei įprastos ląstelės, gali būti, kad šis receptorius atlieka krūties vėžio vaidmenį. Vaistas, trikdantis šį receptorių, gali užkirsti kelią krūties vėžiui arba jį gydyti. Kuriant vaistą, galima atlikti genų ekspresijos profiliavimo eksperimentus, padedančius įvertinti vaisto toksiškumą, galbūt ieškant kintančių citochromo P450 genų, kurie gali būti vaistų metabolizmo biomarkeris, ekspresijos lygio. [2] Genų ekspresijos profiliavimas gali tapti svarbiu diagnostiniu testu. [3] [4]

Žmogaus genome yra maždaug 25 000 genų, kurie veikia kartu ir gamina maždaug 1 000 000 skirtingų baltymų. Taip yra dėl alternatyvaus sujungimo, taip pat dėl ​​to, kad ląstelės atlieka svarbius baltymų pakeitimus po transliacijos modifikacijos po to, kai pirmą kartą jas sukuria, todėl tam tikras genas yra daugelio galimų konkretaus baltymo versijų pagrindas. Bet kokiu atveju, atlikus vieną masės spektrometrijos eksperimentą galima nustatyti apie 2000 baltymų [5] arba 0,2% viso kiekio. Nors žinios apie tikslius baltymus, kuriuos gamina ląstelė (proteomika), yra svarbesnės nei žinojimas, kiek pasiuntinio RNR pagaminama iš kiekvieno geno, genų ekspresijos profiliavimas suteikia kuo platesnį vaizdą per vieną eksperimentą. Tačiau proteomikos metodika tobulėja. Kitoms rūšims, pavyzdžiui, mielėms, per kiek daugiau nei valandą galima nustatyti daugiau nei 4000 baltymų. [6]

Kartais mokslininkas jau turi supratimą apie tai, kas vyksta, hipotezę ir atlieka išraiškos profiliavimo eksperimentą su mintimi galimai paneigti šią hipotezę. Kitaip tariant, mokslininkas konkrečiai prognozuoja išraiškos lygius, kurie gali pasirodyti klaidingi.

Dažniau išraiškos profiliavimas vyksta prieš tai, kai yra pakankamai žinoma apie tai, kaip genai sąveikauja su eksperimentinėmis sąlygomis, kad būtų galima patikrinti hipotezę. Jei nėra hipotezės, nėra ko paneigti, tačiau išraiškos profiliavimas gali padėti nustatyti būsimų eksperimentų kandidato hipotezę. Dauguma ankstyvosios išraiškos profiliavimo eksperimentų ir daugelis dabartinių turi tokią formą [7], kuri vadinama klasės atradimu. Populiarus požiūris į klasių atradimą apima panašių genų ar mėginių grupavimą, naudojant vieną iš daugelio esamų klasterizavimo metodų, tokių kaip tradicinės k-priemonės arba hierarchinis klasterizavimas arba naujesnis MCL. [8] Be to, kad pasirinktų grupavimo algoritmą, vartotojas paprastai turi pasirinkti tinkamą duomenų objektų artumo matą (atstumą ar panašumą). [9] Aukščiau pateiktame paveikslėlyje pavaizduotas dvimatis klasteris, kuriame panašūs mėginiai (eilutės viršuje) ir panašūs genų zondai (stulpeliai) buvo išvesti taip, kad jie būtų arti vienas kito. Paprasčiausia klasės atradimo forma būtų išvardyti visus genus, kurie pasikeitė daugiau nei tam tikru kiekiu tarp dviejų eksperimentinių sąlygų.

Klasės prognozavimas yra sunkesnis nei klasės atradimas, tačiau jis leidžia atsakyti į tiesioginės klinikinės reikšmės klausimus, pavyzdžiui, atsižvelgiant į šį profilį, kokia yra tikimybė, kad šis pacientas reaguos į šį vaistą? Tam reikia daugybės profilių, kurie atsiliepė ir neatsakė, pavyzdžių, taip pat kryžminio patvirtinimo metodų, kad būtų galima juos atskirti.

Apskritai, išraiškos profiliavimo tyrimai praneša apie tuos genus, kurie pakeitus eksperimentines sąlygas parodė statistiškai reikšmingus skirtumus. Paprastai tai yra nedidelė genomo dalis dėl kelių priežasčių. Pirma, skirtingos ląstelės ir audiniai išreiškia genų pogrupį kaip tiesioginę ląstelių diferenciacijos pasekmę, todėl daugelis genų yra išjungti. Antra, daugelis genų koduoja baltymus, reikalingus išgyvenimui labai konkrečiais kiekiais, todėl daugelis genų nesikeičia. Trečia, ląstelės naudoja daugybę kitų mechanizmų, skirtų baltymams reguliuoti, ne tik keičia mRNR kiekį, todėl šie genai gali išlikti nuosekliai išreikšti net tada, kai baltymų koncentracija didėja ir mažėja. Ketvirta, finansiniai suvaržymai apriboja išraiškos profiliavimo eksperimentus su nedideliu to paties geno stebėjimų skaičiumi tomis pačiomis sąlygomis, sumažindami statistinę eksperimento galią, todėl eksperimentui neįmanoma nustatyti svarbių, bet subtilių pokyčių. Galiausiai, norint aptarti kiekvieno reguliuojamo geno biologinę reikšmę, reikia įdėti daug pastangų, todėl mokslininkai dažnai apsiriboja savo aptarimu. Naujesni „microarray“ analizės metodai automatizuoja tam tikrus biologinės reikšmės priskyrimo išraiškos profiliavimo rezultatams aspektus, tačiau tai išlieka labai sudėtinga problema.

Santykinai trumpas genų sąrašų, paskelbtų iš ekspresijos profiliavimo eksperimentų, ilgis riboja tai, kiek eksperimentai, atlikti skirtingose ​​laboratorijose, sutinka. Pateikdami išraiškos profiliavimo rezultatus į viešai prieinamą „microarray“ duomenų bazę, tyrėjai gali įvertinti išraiškos modelius už paskelbtų rezultatų ribų, galbūt nustatydami panašumą su savo darbu.

Tiek DNR mikroschemose, tiek kiekybiniame PGR naudojamas papildomas nukleorūgščių sekų pirmenybės surišimas arba „bazinis susiejimas“, ir abu jie naudojami genų ekspresijos profiliavimui, dažnai nuosekliai. Nors didelio našumo DNR mikroschemoms trūksta qPCR kiekybinio tikslumo, kelių dešimčių genų genų ekspresijos matavimas per qPCR užtrunka maždaug tiek pat laiko, kaip ir viso genomo matavimas naudojant DNR mikroschemas. Taigi dažnai prasminga atlikti pusiau kiekybinius DNR mikroschemų analizės eksperimentus, siekiant nustatyti genus kandidatus, tada atlikti qPCR kai kuriems įdomiausiems genams kandidatams, kad būtų patvirtinti „microarray“ rezultatai. Kiti eksperimentai, tokie kaip kai kurių skirtingai išreikštų genų baltymų produktų Western blot, daro išvadas, pagrįstas ekspresijos profiliu, įtikinamesnes, nes mRNR lygis nebūtinai koreliuoja su išreikšto baltymo kiekiu.

Mikroblokų duomenų analizė tapo intensyvių tyrimų sritimi. [10] Vien teigiant, kad genų grupę reguliavo bent dvigubai, kai tai buvo įprasta praktika, trūksta tvirto statistinio pagrindo. Jei kiekvienoje grupėje yra penki ar mažiau pakartojimų, būdingų mikroschemoms, vienas nepaprastas stebėjimas gali sukurti akivaizdų skirtumą, didesnį nei du kartus. Be to, savavališkas kartelės nustatymas dvigubai nėra biologiškai pagrįstas, nes pašalinama daugybė genų, turinčių akivaizdžią biologinę reikšmę.

Užuot identifikavę skirtingai išreikštus genus, naudodami lenkimo keitimo ribą, galite naudoti įvairius statistinius testus arba įvairius testus, tokius kaip ANOVA, kurie visi atsižvelgia ir į raukšlių pasikeitimą, ir į kintamumą, kad sukurtų p reikšmę-įvertinimą, kaip dažnai mes stebėkite duomenis tik atsitiktinai. Taikyti p reikšmes mikroschemoms apsunkina daugybė susijusių palyginimų (genų). Pavyzdžiui, paprastai manoma, kad p-reikšmė 0,05 rodo reikšmingumą, nes ji įvertina 5% tikimybę, kad duomenys bus atsitiktinai stebimi. Tačiau naudojant 10 000 genų mikroschemoje, 500 genų būtų identifikuoti kaip reikšmingi esant p & lt 0,05, net jei nebūtų skirtumų tarp eksperimentinių grupių. Vienas akivaizdus sprendimas yra laikyti reikšmingais tik tuos genus, kurie atitinka daug griežtesnį p vertės kriterijų, pvz., Galima atlikti Bonferroni korekciją p reikšmėms arba naudoti klaidingo atradimo rodiklio skaičiavimą, kad būtų galima koreguoti p reikšmes proporcingai skaičiui. lygiagrečių bandymų. Deja, šie metodai gali sumažinti reikšmingų genų skaičių iki nulio, net jei genai iš tikrųjų yra skirtingai išreikšti. Current statistics such as Rank products aim to strike a balance between false discovery of genes due to chance variation and non-discovery of differentially expressed genes. Commonly cited methods include the Significance Analysis of Microarrays (SAM) [11] and a wide variety of methods are available from Bioconductor and a variety of analysis packages from bioinformatics companies.

Selecting a different test usually identifies a different list of significant genes [12] since each test operates under a specific set of assumptions, and places a different emphasis on certain features in the data. Many tests begin with the assumption of a normal distribution in the data, because that seems like a sensible starting point and often produces results that appear more significant. Some tests consider the joint distribution of all gene observations to estimate general variability in measurements, [13] while others look at each gene in isolation. Many modern microarray analysis techniques involve bootstrapping (statistics), machine learning or Monte Carlo methods. [14]

As the number of replicate measurements in a microarray experiment increases, various statistical approaches yield increasingly similar results, but lack of concordance between different statistical methods makes array results appear less trustworthy. The MAQC Project [15] makes recommendations to guide researchers in selecting more standard methods (e.g. using p-value and fold-change together for selecting the differentially expressed genes) so that experiments performed in different laboratories will agree better.

Different from the analysis on differentially expressed individual genes, another type of analysis focuses on differential expression or perturbation of pre-defined gene sets and is called gene set analysis. [16] [17] Gene set analysis demonstrated several major advantages over individual gene differential expression analysis. [16] [17] Gene sets are groups of genes that are functionally related according to current knowledge. Therefore, gene set analysis is considered a knowledge based analysis approach. [16] Commonly used gene sets include those derived from KEGG pathways, Gene Ontology terms, gene groups that share some other functional annotations, such as common transcriptional regulators etc. Representative gene set analysis methods include Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), [16] which estimates significance of gene sets based on permutation of sample labels, and Generally Applicable Gene-set Enrichment (GAGE), [17] which tests the significance of gene sets based on permutation of gene labels or a parametric distribution.

While the statistics may identify which gene products change under experimental conditions, making biological sense of expression profiling rests on knowing which protein each gene product makes and what function this protein performs. Gene annotation provides functional and other information, for example the location of each gene within a particular chromosome. Some functional annotations are more reliable than others some are absent. Gene annotation databases change regularly, and various databases refer to the same protein by different names, reflecting a changing understanding of protein function. Use of standardized gene nomenclature helps address the naming aspect of the problem, but exact matching of transcripts to genes [18] [19] remains an important consideration.

Having identified some set of regulated genes, the next step in expression profiling involves looking for patterns within the regulated set. Do the proteins made from these genes perform similar functions? Are they chemically similar? Do they reside in similar parts of the cell? Gene ontology analysis provides a standard way to define these relationships. Gene ontologies start with very broad categories, e.g., "metabolic process" and break them down into smaller categories, e.g., "carbohydrate metabolic process" and finally into quite restrictive categories like "inositol and derivative phosphorylation".

Genes have other attributes beside biological function, chemical properties and cellular location. One can compose sets of genes based on proximity to other genes, association with a disease, and relationships with drugs or toxins. The Molecular Signatures Database [20] and the Comparative Toxicogenomics Database [21] are examples of resources to categorize genes in numerous ways.

Regulated genes are categorized in terms of what they are and what they do, important relationships between genes may emerge. [23] For example, we might see evidence that a certain gene creates a protein to make an enzyme that activates a protein to turn on a second gene on our list. This second gene may be a transcription factor that regulates yet another gene from our list. Observing these links we may begin to suspect that they represent much more than chance associations in the results, and that they are all on our list because of an underlying biological process. On the other hand, it could be that if one selected genes at random, one might find many that seem to have something in common. In this sense, we need rigorous statistical procedures to test whether the emerging biological themes is significant or not. That is where gene set analysis [16] [17] comes in.

Cause and effect relationships Edit

Fairly straightforward statistics provide estimates of whether associations between genes on lists are greater than what one would expect by chance. These statistics are interesting, even if they represent a substantial oversimplification of what is really going on. Here is an example. Suppose there are 10,000 genes in an experiment, only 50 (0.5%) of which play a known role in making cholesterol. The experiment identifies 200 regulated genes. Of those, 40 (20%) turn out to be on a list of cholesterol genes as well. Based on the overall prevalence of the cholesterol genes (0.5%) one expects an average of 1 cholesterol gene for every 200 regulated genes, that is, 0.005 times 200. This expectation is an average, so one expects to see more than one some of the time. The question becomes how often we would see 40 instead of 1 due to pure chance.

According to the hypergeometric distribution, one would expect to try about 10^57 times (10 followed by 56 zeroes) before picking 39 or more of the cholesterol genes from a pool of 10,000 by drawing 200 genes at random. Whether one pays much attention to how infinitesimally small the probability of observing this by chance is, one would conclude that the regulated gene list is enriched [24] in genes with a known cholesterol association.

One might further hypothesize that the experimental treatment regulates cholesterol, because the treatment seems to selectively regulate genes associated with cholesterol. While this may be true, there are a number of reasons why making this a firm conclusion based on enrichment alone represents an unwarranted leap of faith. One previously mentioned issue has to do with the observation that gene regulation may have no direct impact on protein regulation: even if the proteins coded for by these genes do nothing other than make cholesterol, showing that their mRNA is altered does not directly tell us what is happening at the protein level. It is quite possible that the amount of these cholesterol-related proteins remains constant under the experimental conditions. Second, even if protein levels do change, perhaps there is always enough of them around to make cholesterol as fast as it can be possibly made, that is, another protein, not on our list, is the rate determining step in the process of making cholesterol. Finally, proteins typically play many roles, so these genes may be regulated not because of their shared association with making cholesterol but because of a shared role in a completely independent process.

Bearing the foregoing caveats in mind, while gene profiles do not in themselves prove causal relationships between treatments and biological effects, they do offer unique biological insights that would often be very difficult to arrive at in other ways.

Using patterns to find regulated genes Edit

As described above, one can identify significantly regulated genes first and then find patterns by comparing the list of significant genes to sets of genes known to share certain associations. One can also work the problem in reverse order. Here is a very simple example. Suppose there are 40 genes associated with a known process, for example, a predisposition to diabetes. Looking at two groups of expression profiles, one for mice fed a high carbohydrate diet and one for mice fed a low carbohydrate diet, one observes that all 40 diabetes genes are expressed at a higher level in the high carbohydrate group than the low carbohydrate group. Regardless of whether any of these genes would have made it to a list of significantly altered genes, observing all 40 up, and none down appears unlikely to be the result of pure chance: flipping 40 heads in a row is predicted to occur about one time in a trillion attempts using a fair coin.

For a type of cell, the group of genes whose combined expression pattern is uniquely characteristic to a given condition constitutes the gene signature of this condition. Ideally, the gene signature can be used to select a group of patients at a specific state of a disease with accuracy that facilitates selection of treatments. [25] [26] Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [16] and similar methods [17] take advantage of this kind of logic but uses more sophisticated statistics, because component genes in real processes display more complex behavior than simply moving up or down as a group, and the amount the genes move up and down is meaningful, not just the direction. In any case, these statistics measure how different the behavior of some small set of genes is compared to genes not in that small set.

GSEA uses a Kolmogorov Smirnov style statistic to see whether any previously defined gene sets exhibited unusual behavior in the current expression profile. This leads to a multiple hypothesis testing challenge, but reasonable methods exist to address it. [27]

Expression profiling provides new information about what genes do under various conditions. Overall, microarray technology produces reliable expression profiles. [28] From this information one can generate new hypotheses about biology or test existing ones. However, the size and complexity of these experiments often results in a wide variety of possible interpretations. In many cases, analyzing expression profiling results takes far more effort than performing the initial experiments.

Most researchers use multiple statistical methods and exploratory data analysis before publishing their expression profiling results, coordinating their efforts with a bioinformatician or other expert in DNA microarrays. Good experimental design, adequate biological replication and follow up experiments play key roles in successful expression profiling experiments.


Data Visualization

Plotting counts

DESeq2 offers a function called plotCounts() that takes a DESeqDataSet that has been run through the pipeline, the name of a gene, and the name of the variable in the colData that you’re interested in, and plots those values. See the help for ?plotCounts . Let’s first see what the gene ID is for the CRISPLD2 gene using res %>% filter(symbol=="CRISPLD2") . Now, let’s plot the counts, where our intgroup , or “interesting group” variable is the “dex” column.

That’s just okay. Keep looking at the help for ?plotCounts . Notice that we could have actually returned the data instead of plotting. We could then pipe this to ggplot and make our own figure. Let’s make a boxplot.

MA & Volcano plots

Let’s make some commonly produced visualizations from this data. First, let’s mutate our results object to add a column called sig that evaluates to TRUE if padj<0.05, and FALSE if not, and NA if padj is also NA.

Exercise 5

Look up the Wikipedia articles on MA plots and volcano plots. An MA plot shows the average expression on the X-axis and the log fold change on the y-axis. A volcano plot shows the log fold change on the X-axis, and the (-log_<10>) of the p-value on the Y-axis (the more significant the p-value, the larger the (-log_<10>) of that value will be).

  1. Make an MA plot. Use a (log_<10>) -scaled x-axis, color-code by whether the gene is significant, and give your plot a title. It should look like this. What’s the deal with the gray points? Why are they missing? Go to the DESeq2 website on Bioconductor and look through the vignette for “Independent Filtering.”

Transformacija

To test for differential expression we operate on raw counts. But for other downstream analyses like heatmaps, PCA, or clustering, we need to work with transformed versions of the data, because it’s not clear how to best compute a distance metric on untransformed counts. The go-to choice might be a log transformation. But because many samples have a zero count (and (log(0)=-infty) , you might try using pseudocounts, i. e. (y = log(n + 1)) or more generally, (y = log(n + n_0)) , where (n) represents the count values and (n_0) is some positive constant.

But there are other approaches that offer better theoretical justification and a rational way of choosing the parameter equivalent to (n_0) , and they produce transformed data on the log scale that’s normalized to library size. One is called a variance stabilizing transformation (VST), and it also removes the dependence of the variance on the mean, particularly the high variance of the log counts when the mean is low.

Let’s do some exploratory plotting of the data using principal components analysis on the variance stabilized data from above. Let’s use the DESeq2-provided plotPCA function. See the help for ?plotPCA and notice that it also has a returnData option, just like plotCounts .

Principal Components Analysis (PCA) is a dimension reduction and visualization technique that is here used to project the multivariate data vector of each sample into a two-dimensional plot, such that the spatial arrangement of the points in the plot reflects the overall data (dis)similarity between the samples. In essence, principal component analysis distills all the global variation between samples down to a few variables called principal components. The majority of variation between the samples can be summarized by the first principal component, which is shown on the x-axis. The second principal component summarizes the residual variation that isn’t explained by PC1. PC2 is shown on the y-axis. The percentage of the global variation explained by each principal component is given in the axis labels. In a two-condition scenario (e.g., mutant vs WT, or treated vs control), you might expect PC1 to separate the two experimental conditions, so for example, having all the controls on the left and all experimental samples on the right (or vice versa - the units and directionality isn’t important). The secondary axis may separate other aspects of the design - cell line, time point, etc. Very often the experimental design is reflected in the PCA plot, and in this case, it is. But this kind of diagnostic can be useful for finding outliers, investigating batch effects, finding sample swaps, and other technical problems with the data. This YouTube video from the Genetics Department at UNC gives a very accessible explanation of what PCA is all about in the context of a gene expression experiment, without the need for an advanced math background. Pažiūrėk.

Bonus: Heatmaps

Heatmaps are complicated, and are often poorly understood. It’s a type of visualization used very often in high-throughput biology where data are clustered on rows and columns, and the actual data is displayed as tiles on a grid, where the values are mapped to some color spectrum. Our R useRs group MeetUp had a session on making heatmaps, which I summarized in this blog post. Take a look at the code from that meetup, and the documentation for the aheatmap function in the NMF package to see if you can re-create this image. Here, I’m clustering all samples using the top 25 most differentially regulated genes, labeling the rows with the gene symbol, and putting two annotation color bars across the top of the main heatmap panel showing treatment and cell line annotations from our metadata. Take a look at the Rmarkdown source for this lesson for the code.


The piece of code that you need:

The result is the following:

TLDR No, it can't be done automatiškai. Yes, it is possible.

Each plot ( axes ) in a figure ( figure ) has its own cycle of colors — if you don't force a different color for each plot, all the plots share the same order of colors but, if we pasitempti a bit what "automatically" means, it can be done.

[. ] I have to identify each plot with a different color which should be automatically generated by [Matplotlib].

Bet. Matplotlib automatically generates different colors for each different curve

So why the OP request? If we continue to read, we have

Can you please give me a method to put different colors for different plots in the same figure?

and it make sense, because each plot (each axes in Matplotlib's parlance) has its own color_cycle (or rather, in 2018, its prop_cycle ) and each plot ( axes ) reuses the same colors in the same order.

If this is the meaning of the original question, one possibility is to explicitly name a different color for each plot.

If the plots (as it often happens) are generated in a loop we must have an additional loop variable to override the color automatiškai chosen by Matplotlib.


The whiskers:

The lines coming out from each box extend from the maximum to the minimum values of each set. Together with the box, the whiskers show how big a range there is between those two extremes. Larger ranges indicate wider distribution, that is, more scattered data.

The same thing can be said about the boxes. Short boxes mean their data points consistently hover around the center values. Taller boxes imply more variable data. That’s something to look for when comparing box plots, especially when the medians are similar.

Wider ranges (whisker length, box size) indicate more variable data.