Informacija

Kaip sukurta „Crispr“ vadovo RNR?


Atrodo, kad norint modifikuoti DNR, įvedama orientacinė RNR ir Cripr.

Bet aš negaliu suprasti, kaip sukurta ar sukurta vadovo RNR.

Ar tai paprastas metodas, kurį galima atlikti naudojant paprastą laboratorinę įrangą, ar tai sudėtinga?

Kokia įranga reikalinga jai sukurti?


Naujos rūšies CRISPR technologija skirta RNR, įskaitant RNR virusus, tokius kaip koronavirusas

CRISPR pagrįsti genetiniai ekranai padėjo mokslininkams nustatyti genus, kurie yra pagrindiniai pjautuvinių ląstelių anemijos, vėžio imunoterapijos, plaučių vėžio metastazių ir daugelio kitų ligų dalyviai. Tačiau šių genetinių ekranų apimtis yra ribota: jie gali redaguoti arba nukreipti tik DNR. Daugelyje žmogaus genomo regionų nukreipta DNR gali būti neveiksminga, o kiti organizmai, pvz., RNR virusai, tokie kaip koronavirusas ar gripas, apskritai negali būti taikomi naudojant esamus DNR taikymo CRISPR ekranus.

Šiandien paskelbtame svarbiame naujame mokslo bendruomenės šaltinyje Gamtos biotechnologijos, Niujorko genomo centro ir Niujorko universiteto daktaro Nevilio Sanjanos laboratorijos mokslininkai sukūrė naujos rūšies CRISPR ekrano technologiją, skirtą RNR.

Tyrėjai pasinaudojo neseniai apibūdintu CRISPR fermentu, vadinamu Cas13, kuris nukreiptas į RNR, o ne į DNR. Naudodami „Cas13“, jie sukūrė optimizuotą platformą, skirtą masiškai lygiagrečiams genetiniams ekranams RNR lygiu žmogaus ląstelėse. Ši atrankos technologija gali būti naudojama norint suprasti daugelį RNR reguliavimo aspektų ir nustatyti nekoduojančių RNR, kurios yra RNR molekulės, kurios gaminamos, bet nekoduoja baltymų, funkciją.

Taikydami tūkstančius skirtingų žmogaus RNR transkriptų vietų, mokslininkai sukūrė mašininiu mokymusi pagrįstą nuspėjamąjį modelį, kad paspartintų efektyviausių Cas13 vadovo RNR nustatymą. Nauja technologija yra prieinama tyrėjams per interaktyvią svetainę ir atviro kodo įrankių rinkinį, kad būtų galima numatyti RNR efektyvumą pagal pasirinktinius RNR taikinius, ir pateikia iš anksto sukurtus vadovo RNR visiems žmogaus baltymus koduojantiems genams.

„Tikimės, kad į RNR nukreipti Cas13 fermentai turės didelį poveikį molekulinei biologijai ir medicinos reikmėms, tačiau mažai žinoma apie vadovo RNR dizainą, skirtą dideliam taikymo efektyvumui“,-sakė vyresnysis tyrimo autorius dr. Sanjana. „Mes ketinome tai pakeisti atlikdami nuodugnų ir sistemingą tyrimą, kad sukurtume pagrindinius principus ir nuspėjamąjį modeliavimą efektyviausiam vadovo dizainui“.

Daktaras Sanjana yra pagrindinis fakulteto narys Niujorko genomo centre, Niujorko universiteto biologijos docentas ir Niujorko medicinos mokyklos neurologijos ir fiziologijos docentas.

Cas13 fermentai yra VI tipo CRISPR (klasteriškai reguliariai susikertantys trumpi palindrominiai pasikartojimai) fermentai, kurie neseniai buvo identifikuoti kaip programuojami RNR vadovaujami RNR taikantys baltymai, turintys nukleazės aktyvumą, leidžiantį sunaikinti tikslinį geną nekeičiant genomo. Dėl šios savybės Cas13 yra potencialiai reikšmingas vaistas, turintis įtakos genų ekspresijai, nekeičiant genomo sekos.

"Tokias technologines naujoves mes skatiname ir kuriame Niujorko genomo centre. Ši naujausia" Sanjana Lab "CRISPR technologija turi įdomių pasekmių genomikos ir tiksliosios medicinos srityse", - sakė Evnin šeimos daktaras Tomas Maniatis Niujorko genomo centro mokslinis direktorius ir vykdomasis direktorius.

Mokslo doktorantas Hansas Hermannas Wesselsas ir doktorantas Alejandro M & eacutendez-Mancilla, kurie yra pirmieji tyrimo autoriai, sukūrė naujų Cas13 pagrįstų įrankių rinkinį ir atliko nuorašo plytelių klojimo ir permutacijos ekraną žinduolių ląstelėse. Iš viso tyrėjai surinko informaciją daugiau nei 24 000 RNR taikymo vadovų.

„Mes plytelėmis vedame RNR daugelyje skirtingų nuorašų, įskaitant kelis žmogaus genus, kuriuose galėjome lengvai išmatuoti nuorašo numušimą per antikūnų dažymą ir srauto citometriją“,-sakė daktaras Wesselsas. "Pakeliui mes atskleidėme keletą įdomių biologinių įžvalgų, kurios gali išplėsti į RNR nukreiptų Cas13 fermentų taikymą." Pavyzdžiui, tarp komandos išvadų yra įžvalgų apie tai, kurie orientacinės RNR regionai yra svarbesni, norint atpažinti tikslinę RNR. Naudodami tūkstančius orientacinių RNR, turinčių 1, 2 ar 3 vienos raidės neatitikimus savo tikslinei RNR, jie nustatė kritinį „sėklos“ regioną, kuris yra labai jautrus CRISPR vadovo ir tikslo neatitikimams. Šis atradimas padės mokslininkams kurti vadovaujančias RNR, kad būtų išvengta nenumatytos tikslinės RNR veiklos. Kadangi tipinė žmogaus ląstelė išreiškia maždaug 100 000 RNR, tikslus tik numatyto Cas13 taikymas yra gyvybiškai svarbus atrankai ir terapiniam naudojimui.

Be to, kad mes geriau suprastume „Cas13“ tikslus, „sėklinis“ regionas galėtų būti naudojamas naujos kartos biosensoriams, kurie gali tiksliau atskirti glaudžiai susijusias RNR rūšis. Iš viso šis tyrimas padidina ankstesnių Cas13 tyrimų su žinduolių ląstelėmis duomenų taškų skaičių daugiau nei dviem dydžiais.

„Mes labai džiaugiamės galėdami naudoti optimizuotą„ Cas13 “atrankos sistemą, kad galėtume nukreipti į nekoduojančias RNR“,-sakė bendraautorius M & eacutendez-Mancilla. "Tai labai išplečia CRISPR įrankių rinkinį, skirtą genetiniams ir transkriptiniams ekranams." Tyrimo metu mokslininkai pastebėjo ryškų baltymų numušimo skirtumą, kai buvo nukreipti į skirtingus pasiuntinių RNR baltymus koduojančius ir nekoduojančius elementus, ir rado įrodymų, kad Cas13 konkuruoja su kitais RNR surišančiais baltymais, dalyvaujančiais transkripto apdorojime ir sujungime.

Komanda neseniai pasinaudojo savo vadovaujančiu RNR nuspėjamuoju modeliu, kad atliktų ypač kritinę analizę: COVID-19 ekstremali situacija visuomenės sveikatai kyla dėl koronaviruso, kuriame yra RNR, o ne DNR genomas. Naudodami modelį, gautą iš jų masiškai lygiagrečių ekranų, tyrėjai nustatė optimalias orientacines RNR, kurios galėtų būti naudojamos būsimam aptikimui ir terapiniam naudojimui.


Specifinė mutacijos vadovas RNR jungtinei heterozigotinei porfirijai tikslinę bešarminę korekciją CRISPR/Cas9 kamieninėse ląstelėse

CRISPR/Cas9 yra perspektyvi genų korekcijos technologija. Tačiau leidimas dažnai yra dvejopas, todėl sukuriami nekontroliuojami nedideli įterpimai ir išbraukimai (indeliai), kartu atliekantys tikslią korekciją. Mutacijai būdingos orientacinės RNR neseniai buvo išbandytos siekiant ištaisyti dominuojančias paveldimas ligas, tausojant laukinio tipo alelį. Mes išbandėme originalų metodą, kaip ištaisyti sudėtines heterozigotines recesyvines mutacijas. Mes palyginome redagavimo efektyvumą ir genotoksiškumą pagal biallelinę kreipiamąją RNR ir mutantinio alelio specifinę orientacinę RNR iPSC, gautus iš įgimtos eritropoetinės porfirijos paciento, nešiojančio sudėtines heterozigotines mutacijas, dėl kurių buvo panaikintas UROS genas. Mes gavome UROS funkcijų gelbėjimą ir medžiagų apykaitos korekciją su abiem vadovais, galinčiais naudoti klinikinę porfirijos intervenciją. Tačiau, skirtingai nuo biallelinio, specifinio mutanto alelio vadovas neturėjo tikslinės papildomos žalos. Rekomenduojame šią konstrukciją, kad būtų išvengta genotoksinio poveikio ir gauta tikslinė randinė geno korekcija recesyvinei ligai, kuriai dažnai būdingos sudėtinės heterozigotinės mutacijos.

Raktažodžiai: CRISPR/Cas9 junginio heterozigotinė recesyvinė liga įgimta eritropoetinė porfirijos genų terapija iPSC mutacijos specifinis tikslus genomo redagavimas.

Autorių teisės © 2020 Autoriai. Paskelbė Elsevier Inc. Visos teisės saugomos.


CRISPR sistemos

Bakterijos ir archajos turi adaptacinį imunitetą prieš svetimus genetinius elementus, naudojant CRISPR - Cas sistemas. Užsikrėtus, naujos svetimos DNR sekos užfiksuojamos ir integruojamos į šeimininko CRISPR lokusą kaip naujos tarpinės. CRISPR lokusas yra perrašomas ir apdorojamas, kad būtų sukurtos brandžios CRISPR RNR, kiekviena koduojanti unikalią tarpinę seką. Kiekviena crRNR asocijuojasi su Cas efektoriniais baltymais, kurie naudoja crRNR kaip vadovus, kad nutildytų svetimus genetinius elementus, atitinkančius crRNR seką. Mums įdomu išsiaiškinti mechanizmus, kuriais grindžiamas CRISPR-Cas imunitetas, ypač suprasti Cas baltymų funkcijas ir sukurti naujas CRISPR pagrįstas priemones biotechnologijų reikmėms.

CRISPR - Cas sistemos yra labai įvairios ir suskirstytos į daugybę potipių. E. coli tipo I-E sistema naudoja Cascade kompleksą svetimos DNR nutildymui pagal RNR. Kaskadą sudaro Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e ir Cas6e subvienetai ir viena crRNR, sudaranti struktūrą, kuri suriša ir išvynioja dsDNR, kad susidarytų R kilpa. Neseniai mes panaudojome vienos dalelės elektroninės mikroskopijos dsDNA surištos kaskados su Cas3 ir be jo rekonstrukcijas, kad atskleistume, kad „Cascade“ pozicionuoja PAM proksimalinį DNR duplekso galą Cse1 subvienete ir netoli Cas3 asociacijos vietos. Išvada, kad DNR taikinys ir Cas3 kolokalizuojasi su Cse1, reiškia šį subvienetą pagrindiniame tikslo patvirtinimo etape DNR trukdžių metu. Biochemiškai parodome, kad PAM srities bazinis susiejimas yra nereikalingas, norint surišti tikslą, bet yra labai svarbus Cas3 tarpininkaujant. Kartu šie duomenys rodo, kad „Cascade“ Cse1 subvienetas veikia kaip esminis „Cas3“ partneris, atpažindamas DNR taikinio vietas ir padėdamas Cas3 greta PAM, kad būtų užtikrintas skilimas (bendradarbiaujant su Eva Nogales, UC Berkeley, HHMI).

II tipo CRISPR-Cas sistemos naudoja RNR vadovaujamą DNR endonukleazę Cas9, kad sukurtų invazinės DNR dvigubos grandinės pertraukas adaptacinio bakterinio imuninio atsako metu. Cas9 sukeltas skilimas griežtai priklauso nuo to, ar tikslinėje DNR yra protospacer gretimas motyvas (PAM). Galimybė užprogramuoti „Cas9“ DNR skilimui konkrečiose vietose, apibrėžtose vadovo RNR, paskatino jį priimti kaip universalią genomo inžinerijos ir genų reguliavimo platformą. Norėdami suprasti, kaip „Cas9“ naudoja savo vadovaujančią RNR, kad apklaustų tikslines DNR sekas, mes išsprendėme „Cas9“ molekulines struktūras apo, kreipiamąsias su RNR susijusias ir tikslines DNR būsenas. Kristalinės Cas9 struktūros, susietos su vienos kreipiančiosios RNR, atskleidžia konformaciją, kuri skiriasi nuo apo ir su DNR susietų būsenų, kuriose 10 nukleotidų RNR „sėklos“ seka, reikalinga pradiniam DNR tardymui, yra iš anksto užsakyta A formos konformacijoje. Šis orientacinės RNR segmentas yra būtinas, kad Cas9 suformuotų DNR atpažinimo kompetenciją atitinkančią struktūrą, kuri būtų pasirengusi įsitraukti į dvigubos grandinės DNR taikinio sekas. Mes tai suprantame kaip konvergentišką „sėklos“ mechanizmo evoliuciją, primenančią tą, kurį Argonaute baltymai naudoja RNR trukdžių metu eukariotuose.

CRISPR RNR valdomi stebėjimo kompleksai nukreipia svetimą DNR, kad suskaidytų per RNR ir DNR bazės poravimą ir atpažintų unikalią seką, esančią greta tikslinės DNR, vadinamą protospacer gretimu motyvu (PAM). Neseniai mūsų tyrime buvo nagrinėjama, kaip DNR yra išvyniojama per šį įrišimo įvykį ir kaip trumpos 20–30 bazinių porų tikslinės sekos yra efektyviai išdėstytos ir atpažįstamos visuose genomuose. Bendradarbiaudami su Erico Greene'o Kolumbijos universiteto laboratorija, mes pritaikėme vienos molekulės ir masinių biocheminių eksperimentų derinį, kad išspręstume dviejų filogenetiškai nesusijusių kompleksų DNR apklausos mechanizmą: Cas9, į DNR nukreiptą baltymą, esantį II tipo CRISPR-Cas sistemos (S. pyogenes) ir „Cascade“, DNR taikymo kompleksas, randamas IE CRISPR – Cas tipo sistemose (E. coli). Mūsų rezultatai atskleidė, kad tikslinė paieška yra vadovaujama PAM ir kad šie skirtingi RNR valdomi kompleksai susiliejo į bendrą tikslinės DNR atpažinimo mechanizmą.


Paaiškinkite: kaip veikia CRISPR

Mokslininkai DNR redagavimui naudoja įrankį CRISPR/Cas9.

Pasidalinti:

Mokslininkai paprastai vengia šio žodžio stebuklas. Nebent jie kalba apie genų redagavimo įrankį, vadinamą CRISPR, tai yra. „Su CRISPR galite padaryti bet ką“, - sako kai kurie. Kiti tai tiesiog vadina nuostabiu.

Iš tiesų tai nustebino tiek daug žmonių ir taip greitai, kad praėjus vos aštuoneriems metams po to, kai jie tai atrado, Jennifer Doudna ir Emmanuelle Charpentier atsiėmė 2020 metų Nobelio chemijos premiją.

CRISPR reiškia „grupuotas reguliariai tarpusavyje trumpas palindrominis kartojasi “. Tie pasikartojimai randami bakterijų DNR. Jie iš tikrųjų yra mažų virusų gabalų kopijos. Bakterijos jas naudoja kaip puodelių šūvių kolekcijas, kad atpažintų blogus virusus. „Cas9“ yra fermentas kuris gali suskaidyti DNR. Bakterijos kovoja su virusais, siųsdamos fermentą Cas9 susmulkinti virusus, kurių kolekcijoje yra puodelis. Mokslininkai neseniai išsiaiškino, kaip bakterijos tai daro. Dabar laboratorijoje tyrėjai naudoja panašų metodą, kad mikrobų kovos su virusais sistema taptų karščiausia nauja laboratorijos priemone.

Šis CRISPR/Cas9 įrankis pirmą kartą buvo aprašytas 2012 ir 2013 m. Mokslo laboratorijos visame pasaulyje netrukus pradėjo jį naudoti, kad pakeistų organizmo genomą - visą jo DNR nurodymų rinkinį.

Pedagogai ir tėvai, užsiregistruokite „Cheat Sheet“

Savaitės atnaujinimai padės jums naudotis Mokslo naujienos studentams mokymosi aplinkoje

Šis įrankis gali greitai ir efektyviai patobulinti beveik bet kurio augalo ar gyvūno geną. Mokslininkai jau naudojo jį genetinėms gyvūnų ligoms nustatyti, kovai su virusais ir uodų sterilizavimui. Jie taip pat jį naudojo ruošdami kiaulių organus žmonių transplantacijai ir didindami biglių raumenis.

Iki šiol didžiausias CRISPR poveikis buvo juntamas pagrindinėse biologijos laboratorijose. Šį nebrangų genų redaktorių lengva naudoti. Tai leido tyrėjams įsigilinti į pagrindines gyvenimo paslaptis. Ir jie gali tai padaryti tokiu būdu, kuris anksčiau buvo sunkus, jei ne neįmanomas.

Robertas Reedas yra vystymosi biologas Kornelio universitete Ithakoje, NY. Jis lygina CRISPR su kompiuterio pele. „Galite tiesiog nukreipti jį į genomo vietą ir toje vietoje galite padaryti viską, ko norite“.

Iš pradžių tai reiškė viską, kas apėmė DNR pjaustymą. Pradinė CRISPR/Cas9 forma yra nukreipimo įtaisas (CRISPR dalis), nukreipiantis molekulines žirkles (fermentas Cas9) į tikslinę DNR dalį. Kartu jie veikia kaip genų inžinerijos sparnuotoji raketa, kuri išjungia ar pataiso geną arba įterpia kažką naujo ten, kur „Cas9“ žirklės šiek tiek sumažėjo. Naujesnės CRISPR versijos vadinamos „baziniais redaktoriais“. Jie gali redaguoti genetinę medžiagą po vieną bazę, nepjaustydami. Jie labiau panašūs į pieštuką nei į žirkles.

Štai kaip tai veikia

Mokslininkai pradeda nuo RNR. Tai molekulė, kuri gali nuskaityti genetinę informaciją DNR. RNR randa vietą branduolys langelį, kuriame turėtų būti atliekama tam tikra redagavimo veikla. (Branduolys yra ląstelės skyrius, kuriame saugoma didžioji dalis genetinės medžiagos.) Šis vadovas RNR ganytojus Cas9 nustato tiksliai DNR vietoje, kur reikia pjauti. Tada „Cas9“ užsifiksuoja ant dvigubos grandinės DNR ir išpakuos ją.

Tai leidžia vadovaujančiai RNR susieti su tam tikra DNR sritimi, į kurią ji nukreipta. Cas9 nukopijuoja DNR šioje vietoje. Dėl to nutrūksta abi DNR molekulės grandinės. Ląstelė, pajutusi problemą, pataiso pertrauką.

Pataisius pertrauką, genas gali būti išjungtas (lengviausia tai padaryti). Arba šis remontas gali ištaisyti klaidą ar net įterpti naują geną (daug sunkesnis procesas).

Ląstelės paprastai ištaiso savo DNR pertrauką, klijuodami laisvus galus atgal. Tai nerūpestingas procesas. Dažnai tai sukelia klaidą, kuri išjungia kai kuriuos genus. Tai gali neatrodyti naudinga, bet kartais tai yra.

Mokslininkai nukirpo DNR naudodami CRISPR/Cas9, kad pakeistų genus, arba mutacijos. Lygindami ląsteles su mutacija ir be jos, mokslininkai kartais gali išsiaiškinti, koks yra įprastas baltymo vaidmuo. Arba nauja mutacija gali padėti jiems suprasti genetines ligas. CRISPR/Cas9 taip pat gali būti naudingas žmogaus ląstelėse, išjungiant tam tikrus genus, pavyzdžiui, tuos, kurie vaidina svarbų vaidmenį paveldintose ligose.

„Originalus„ Cas9 “yra kaip Šveicarijos kariuomenės peilis, turintis tik vieną pritaikymą: tai peilis“, - sako Gene Yeo. Jis yra RNR biologas Kalifornijos universitete, San Diege. Tačiau Yeo ir kiti prie išblukusių ašmenų pritvirtino kitus baltymus ir chemines medžiagas. Tai peilį pavertė daugiafunkciniu įrankiu.

CRISPR/Cas9 ir susijusios priemonės dabar gali būti naudojamos naujais būdais, pavyzdžiui, pakeisti vieną nukleotidų bazę - vieną genetinio kodo raidę - arba pridėti fluorescencinį baltymą, kad būtų pažymėta vieta DNR, kurią mokslininkai nori stebėti. Mokslininkai taip pat gali naudoti šią genetinę „cut-and-paste“ technologiją, norėdami įjungti arba išjungti genus.

Šis naujų CRISPR naudojimo būdų sprogimas nesibaigė. Feng Zhang yra molekulinis biologas Masačusetso technologijos institute Kembridže. Jis buvo vienas pirmųjų mokslininkų, pasinaudojusių „Cas9“ žirklėmis. „Sritis taip sparčiai žengia į priekį“, - sako jis. „Tik pažvelgus į tai, kiek toli nuėjome ... manau, kad tai, ką pamatysime per ateinančius kelerius metus, bus tiesiog nuostabu“.

Ši istorija buvo atnaujinta 2020 m. Spalio 8 d., Siekiant atkreipti dėmesį į Nobelio komiteto sprendimą skirti CRISPR atradimą 2020 m. Chemijos premija.

Galios žodžiai

taikymas Konkretus kažko panaudojimas ar funkcija.

bazė (genetikoje) Sutrumpinta termino nukleobazė versija. Šios bazės yra DNR ir RNR molekulių statybiniai blokai.

biologija Gyvųjų būtybių tyrimas. Jas tyrinėjantys mokslininkai yra žinomi kaip biologai.

Cas9 Fermentas, kurį genetikai dabar naudoja genams redaguoti. Jis gali perpjauti DNR, leisdamas pataisyti pažeistus genus, susieti naujus arba išjungti tam tikrus genus. „Cas9“ yra gabenama į vietą, kurioje turėtų būti supjaustyti, naudojant CRISPR, genetinių vadovų tipą. Cas9 fermentas atsirado iš bakterijų. Kai virusas įsiskverbia į bakteriją, šis fermentas gali suskaidyti mikrobų DNR, todėl jis yra nekenksmingas.

ląstelė Mažiausias organizmo struktūrinis ir funkcinis vienetas. Paprastai per mažas, kad būtų matomas plika akimi, jį sudaro vandeningas skystis, apsuptas membranos ar sienos. Gyvūnai yra pagaminti iš tūkstančių iki trilijonų ląstelių, priklausomai nuo jų dydžio. Kai kuriuos organizmus, tokius kaip mielės, pelėsiai, bakterijos ir kai kurie dumbliai, sudaro tik viena ląstelė.

cheminis Medžiaga, sudaryta iš dviejų ar daugiau atomų, kurie susijungia (susieja) fiksuota proporcija ir struktūra. Pavyzdžiui, vanduo yra cheminė medžiaga, sudaryta iš dviejų vandenilio atomų, sujungtų su vienu deguonies atomu. Jo cheminis simbolis yra H2O.

CRISPR Sutrumpinimas - išreikštas traškesnis - sąvokai „grupuoti reguliariai tarpusavyje esantys trumpi palindrominiai pasikartojimai“. Tai yra RNR dalys, informacija pernešanti molekulė. Jie nukopijuoti iš virusų, užkrečiančių bakterijas, genetinės medžiagos. Kai bakterija susiduria su virusu, su kuriuo ji buvo anksčiau paveikta, ji sukuria CRISPR RNR kopiją, kurioje yra to viruso genetinė informacija. Tada RNR vadovauja fermentui, vadinamam Cas9, suskaidyti virusą ir padaryti jį nekenksmingą. Mokslininkai dabar kuria savo CRISPR RNR versijas. Šios laboratorijoje pagamintos RNR padeda fermentui iškirpti specifinius kitų organizmų genus. Mokslininkai juos naudoja kaip genetines žirkles, norėdami redaguoti arba pakeisti specifinius genus, kad galėtų ištirti, kaip genas veikia, atitaisyti pažeistų genų žalą, įterpti naujų genų arba išjungti kenksmingus.

vystantis (biologijoje) Būdvardis, nurodantis pokyčius, kuriuos organizmas patiria nuo pastojimo iki pilnametystės. Tie pokyčiai dažnai susiję su chemija, dydžiu ir kartais net forma.

DNR (sutrumpintai dezoksiribonukleorūgštis) Ilga, dvigubos grandinės ir spiralės formos molekulė daugumoje gyvų ląstelių, atliekanti genetines instrukcijas. Jis pastatytas ant fosforo, deguonies ir anglies atomų stuburo. Visose gyvose būtybėse, pradedant augalais ir gyvūnais, baigiant mikrobais, šios instrukcijos nurodo ląstelėms, kurias molekules gaminti.

inžinerija Tyrimų sritis, kurioje matematika ir mokslas naudojami praktinėms problemoms spręsti.

laukas Studijų sritis, kaip antai: Jos tyrimų sritis buvo biologija. Taip pat terminas, apibūdinantis realią aplinką, kurioje atliekami kai kurie tyrimai, pavyzdžiui, jūroje, miške, kalno viršūnėje ar miesto gatvėje. Tai priešinga dirbtinei aplinkai, pavyzdžiui, tyrimų laboratorijai.

fluorescencinė Gali sugerti ir atkurti šviesą. Ši skleidžiama šviesa yra žinoma kaip fluorescencija.

genas (koreguojamas genetinis) DNR segmentas, koduojantis arba turintis instrukcijas baltymui gaminti. Palikuonys paveldi genus iš savo tėvų. Genai turi įtakos organizmo išvaizdai ir elgesiui.

genomą Visas genų ar genetinės medžiagos rinkinys ląstelėje ar organizme. Šio genetinio paveldėjimo, esančio ląstelėse, tyrimas yra žinomas kaip genomika.

Raumuo Audinių tipas, naudojamas judėti, susitraukiant jo ląstelėms, vadinamoms raumenų skaidulomis. Raumenyse gausu baltymų, todėl plėšriosios rūšys ieško grobio, kuriame yra daug šio audinio.

mutacija (v. mutuoti) Kai kurie pokyčiai, atsirandantys dėl organizmo DNR geno. Kai kurios mutacijos atsiranda natūraliai. Kitus gali sukelti išoriniai veiksniai, tokie kaip tarša, radiacija, vaistai ar kažkas dietoje. Su šiuo pokyčiu susijęs genas vadinamas mutantu.

branduolys Daugiskaita yra branduoliai. (biologijoje) Tanki struktūra, esanti daugelyje ląstelių. Paprastai vienoje apvalioje struktūroje, esančioje membranoje, branduolyje yra genetinės informacijos.

organas (biologijoje) Įvairios organizmo dalys, atliekančios vieną ar daugiau konkrečių funkcijų. Pavyzdžiui, kiaušidės yra organas, gaminantis kiaušinius, smegenys yra organas, kuris interpretuoja nervinius signalus, o augalo šaknys yra organai, kurie priima maistines medžiagas ir drėgmę.

palindromas (adj. palindromic) Žodis, vardas ar frazė, kurių raidžių eilės tvarka tokia pati, kai skaitoma į priekį arba atgal. Pavyzdžiui, tėtis ir mama abu yra palindromai.

baltymas Junginys, pagamintas iš vienos ar kelių ilgų aminorūgščių grandinių. Baltymai yra esminė visų gyvų organizmų dalis. Jie sudaro gyvų ląstelių, raumenų ir audinių pagrindą, taip pat atlieka darbą ląstelių viduje. Hemoglobinas kraujyje ir antikūnai, kurie bando kovoti su infekcijomis, yra vieni žinomiausių, savarankiškų baltymų. Vaistai dažnai veikia prisijungdami prie baltymų.

RNR Molekulė, padedanti „perskaityti“ genetinę informaciją, esančią DNR. Ląstelės molekulinė mašina skaito DNR, kad sukurtų RNR, ir tada skaito RNR, kad sukurtų baltymus.

žyma (biologijoje) Prie gyvūno pritvirtinti tam tikrą tvirtą juostą ar instrumentų paketą. Kartais žyma naudojama kiekvienam asmeniui suteikti unikalų identifikavimo numerį. Pritvirtintas prie gyvūno kojos, ausies ar kitos kūno dalies, jis gali veiksmingai tapti gyvūno „vardu“. Kai kuriais atvejais žyma taip pat gali rinkti informaciją iš gyvūną supančios aplinkos. Tai padeda mokslininkams suprasti ir aplinką, ir gyvūno vaidmenį joje.

Citatos

Žurnalas: S. Wang ir kt. RNR aptamerio pagrindu sukurta dviejų spalvų CRISPR ženklinimo sistema. Mokslinės ataskaitos. T. 6, 2016 m. Gegužės 27 d., P. 26857. doi: 10.1038/srep26857.

Žurnalas: A. C. Komoras ir kt. Programuojamas genomo DNR tikslinės bazės redagavimas be dvigubos grandinės DNR skilimo. Gamta. T. 533, 2016 m. Gegužės 19 d., Paskelbta internete 2016 m. Balandžio 20 d., P. 420. doi: 10.1038/nature17946.

Žurnalas: D. A. Nelles ir kt. Programuojamas RNR sekimas gyvose ląstelėse su CRISPR/Cas9. Ląstelė. T. 165, 2016 m. Balandžio 7 d., P. 488. doi: 10.1016/j.cell.2016.02.054.

Apie Tina Hesman Saey

Tina Hesman Saey yra vyresnioji rašytoja ir praneša apie molekulinę biologiją. Ji turi daktaro laipsnį. molekulinės genetikos srityje Vašingtono universitete Sent Luise ir mokslo žurnalistikos magistro laipsnį Bostono universitete.

Klasės ištekliai šiam straipsniui Sužinokite daugiau

Šiame straipsnyje rasite nemokamų mokytojų išteklių. Registruokitės norėdami pasiekti:


CRISPR atradimas atveria kelią naujam COVID-19 tyrimo metodui

Nauja platforma LEOPARD gali aptikti įvairius su ligomis susijusius biologinius žymenis tik vieno testo metu. Kreditas: Sandy Westermannas / HIRI

Dauguma įprastų molekulinių diagnostikų paprastai aptinka tik vieną su liga susijusį biomarkerį. Puikūs pavyzdžiai yra PGR testai, šiuo metu naudojami diagnozuoti COVID-19, nustatant konkrečią SARS-CoV-2 seką. Tokie vadinamieji „singleplex“ metodai suteikia patikimų rezultatų, nes yra kalibruojami pagal vieną biomarkerį. Tačiau norint nustatyti, ar pacientas yra užsikrėtęs nauju SARS-CoV-2 variantu, ar visiškai kitu patogenu, reikia vienu metu ištirti daugybę skirtingų biomarkerių.

Mokslininkai iš Helmholtzo RNR pagrįstų infekcijų tyrimų instituto (HIRI) ir Juliaus Maksimiliano universiteto (JMU) Viurcburge dabar atvėrė kelią visiškai naujai diagnostinei platformai su LEOPARD. Tai CRISPR pagrįstas metodas, kuris yra labai daugkartinis, galintis aptikti įvairius su liga susijusius biomarkerius tik vieno tyrimo metu.

LEOPARD, kuris reiškia „panaudotų inžinerinių tracrRNR ir tikslinių DNR panaudojimas lygiagrečiai RNR aptikimui“, yra pagrįstas išvada, kad DNR pjovimas naudojant Cas9 gali būti susijęs su specifinės ribonukleino rūgšties (RNR) buvimu. Ši nuoroda leidžia LEOPARD vienu metu aptikti daug RNR, atveriant galimybes tuo pačiu metu aptikti RNR iš virusų ir kitų patogenų paciento mėginyje.

Šiandien paskelbtas tyrimas Mokslas inicijavo Chase Beisel, JMU profesorė ir HIRI tyrimų grupės vadovė, ir profesorė Cynthia Sharma iš JMU Molekulinės infekcijos biologijos instituto (IMIB). „Naudodamiesi LEOPARD, mums pavyko aptikti devynių skirtingų virusų RNR fragmentus“,-sako Beiselis. kantrus “.

CRISPR-Cas9 iš esmės yra žinomas kaip biomolekulinė priemonė genomui redaguoti. Čia CRISPR-Cas9 veikia kaip molekulinės žirklės, kurios pjauna specifines DNR sekas. Tas pačias žirkles bakterijos natūraliai naudoja DNR, kuri yra susijusi su invaziniais virusais, pjaustymui. Nesvarbu, ar redaguoja genomus, ar pašalina virusus, „Cas9“ pjovimui vadovauja vadovaujančiosios RNR. Bakterijose randamos orientacinės RNR turi suporuoti su atskira RNR, vadinama tracrRNR. Tada RNR pora gali dirbti su „Cas9“, kad nukreiptų DNR pjovimą.

Netikėtas atradimas

Buvo manoma, kad tracrRNR susieja tik su vadovaujančiomis RNR, gaunamomis iš antivirusinės sistemos. Tačiau Viurcburgo mokslininkai atrado, kad tracrRNR yra suporuota su kitomis RNR, paverčiant jas vadovaujančiomis RNR. Cynthia Sharma, IMIB Molekulinės infekcijos biologijos II katedros pirmininkė ir JMU Infekcinių ligų tyrimų centro (ZINF) atstovė, buvo nustebinta šio atradimo: „Kai mes ieškojome RNR, jungiančių prie Cas9 mūsų modelio organizme Campylobacter, mes stebėtinai radome kad mes aptikome ne tik orientacines RNR, bet ir kitus ląstelės RNR fragmentus, kurie atrodė kaip orientacinės RNR.

LEOPARD diagnostikos platforma remiasi šiuo atradimu. „Mes supratome, kaip perprogramuoti tracrRNR, kad nuspręstume, kurios RNR tampa pagrindinėmis RNR“, - sako Beiselis. "Stebėdami atitinkamų DNR rinkinį, galime nustatyti, kurios RNR buvo mėginyje, remiantis kuriomis DNR yra supjaustytos. Kaip vykstančios pandemijos dalis, LEOPARD galėtų leisti gydytojui išsiaiškinti, ar pacientas yra užsikrėtęs SARS-CoV -2, jei tai yra unikalus variantas ir ar mėginys buvo paimtas teisingai, ar jį reikia pakartoti -viskas viename bandyme “.

Ateityje „LEOPARD“ našumas gali nykti net daugialypius PGR tyrimus ir kitus metodus. „Ši technologija gali pakeisti medicinos diagnostiką ne tik dėl infekcinių ligų ir atsparumo antibiotikams, bet ir dėl vėžio bei retų genetinių ligų“, - sako Oliveris Kurzai, JMU Higienos ir mikrobiologijos instituto, pateikusio tyrimui pacientų pavyzdžius, direktorius.

„Darbas pabrėžia puikius bendradarbiavimo ir tarpdisciplininius tyrimus, vykstančius čia, Viurcburge“, - sako Jörg Vogel, IMIB ir HIRI, bendros JMU įstaigos su Helmholtz infekcijų tyrimų centru Braunšveige, direktorius. „LEOPARD įspūdingai parodo, kad galime apimti visą papildomą pažangiausių tyrimų Viurcburge spektrą, pradedant RNR tyrimų pagrindais ir baigiant klinikiniais pritaikymais“.


Kaip sukurta „Crispr“ vadovo RNR? - Biologija

Pasirinkite toliau pateiktą formatą, kad surastumėte dominančio geno išjungimo vadovus. & Ndash Visi garantuoti, kad redaguos jūsų tikslinį geną

Sintetinė sgRNR

Vienos dalies vadovo formatas-idealiai tinka sudėtingiems, sunkiai redaguojamiems ląstelių tipams

Sintetinė crRNR

Efektyvus redagavimas, naudojamas daugumoje ląstelių tipų - turi būti naudojamas su sintetine tracrRNR

Lentivirusinė sgRNR

Stabili orientacinė RNR ekspresija ląstelių tipams, kurių negalima transfekuoti

Viskas viename lentivirusinė sgRNR

Sujunkite sgRNR ir Cas9 ekspresiją į vieną vektorių

Individualus vadovas RNR

Dizaino vadovas RNR, skirtas naudoti daugiau nei 40 rūšių arba su alternatyvia nukleaze

Užsisakykite pasirinktinį vadovą RNR
CRISPR dizaino įrankis
  • Apžvalga
  • Atrankos vadovas
  • Pagalbiniai duomenys
  • Produktai
  • Garantija

Vadovaujantis RNR programuoja Cas9 nukleazes, skirtas pjaustyti tam tikroje genominėje vietoje. Veiksmingos orientacinės RNR dizainas yra labai svarbus norint pasiekti efektyvų genų išjungimą.

Visi iš anksto suprojektuoti „Edit-R“ vadovo RNR produktai yra sukurti naudojant patvirtintą algoritmą, siekiant maksimaliai padidinti funkcinių baltymų išmušimo tikimybę, o ne tik sukurti dvigubą grandinės pertrauką. Įvertinę tūkstančių dizaino fenotipus, tada patvirtindami mūsų projektavimo taisykles kitose tyrimo sistemose, mes nustatėme standartus, pagal kuriuos nustatomos tikslinės svetainės, kurios labiau linkusios pasiekti funkcinį išjungimą su dideliu specifiškumu.

Sintetinės ir lentivirusinės orientacinės RNR taip pat gali būti pritaikytos papildomoms rūšims, alternatyvioms nukleazėms ar bet kuriam konkrečiam geno regionui, naudojant CRISPR projektavimo įrankį. Tiems, kurie projektuoja vadovą RNR, skilimui naudoja Staph aureus Cas9, „Horizon“ rekomenduoja „NEB EnGen & reg Sau Cas9“ jūsų nukleazei.

Vadovaukitės RNR sistemoje CRISPR-Cas9

Be Cas9 nukleazės ekspresijos, CRISPR-Cas9 sistemai reikalinga specifinė RNR molekulė, skirta įdarbinti ir nukreipti nukleazės aktyvumą į dominančią sritį. Šios orientacinės RNR yra vienos iš dviejų formų:

  1. Sintetinė transaktyvuojanti CRISPR RNR (tracrRNR) ir sintetinė CRISPR RNR (crRNR), skirta suskaldyti dominančią geno tikslinę vietą (1a pav)
  2. Sintetinė arba išreikšta viena kreipiančioji RNR (sgRNR), kurią sudaro ir crRNR, ir tracrRNR kaip viena konstrukcija (1b pav)

1a pav. Cas9 nukleazės iliustracija, užprogramuota crRNR: tracr kompleksas, pjaunantis abi PAM genomo 5 'DNR sruogas

Vadovas RNR pasirinkimo vadovas

Jūsų eksperimentui tinkamiausios orientacinės RNR tipo nustatymas priklausys nuo jūsų konkrečios programos ir ląstelių tipo. Naudokite šią lentelę, kad pasirinktumėte tinkamą vadovo RNR formatą, atitinkantį jūsų konkrečias eksperimentines sąlygas.

Sintetinė crRNR Sintetinė sgRNR Lentivirusinė sgRNR Lentivirusinė viskas viename sgRNR
Garantuota, kad redaguosite jus dominantį geną
Gali būti pritaikytas bet kuriai rūšiai, nukleazei ar redagavimo vietai
RNP suderinamas elektroporacijai
Perkelkite į sunkiai redaguojamas ląsteles, kurių negalima elektroporuoti
Gyventojų praturtinimas naudojant atsparumo antibiotikams žymenis
Galima naudoti „viskas viename“ vektoriuje (sgRNA + Cas9), kad būtų supaprastinta darbo eiga

Pagalbiniai duomenys

„Edit-R“ algoritmo balai koreliuoja su skilimo efektyvumu

10 crRNAs with high functional scores for 10 genes (blue bars) and 10 crRNAs with low functional scores for the same genes (yellow bars) were tested for editing by Next Generation Sequencing. 93% of the high-scoring crRNAs and 32 % of the low scoring crRNAs showed > 40% of editing (indel formation). The Cas9-HEK293T cell line was transfected with 50 nM crRNA:tracrRNA, using 0.25 µL/well of DharmaFECT 1. Seventy-two hours post-transfection, cells were lysed and Nextera transposon-adapted amplicons spanning each crRNA site were generated for every treated sample as well as for a matched control amplicon from untransfected samples. Samples were indexed using the Nextera 96-well index kit and pooled for sequencing on a MiSeq instrument (paired end reads, 2 x 300 length). Reads that passed NGS quality filtering criteria were aligned to the reference file (Bowtie2 v2.1.0). Percent perfect reads were calculated and normalized to the control untransfected samples (Samtools v0.1.12a) the data is presented as normalized percent edited.

CrRNAs with high algorithm functional scores have also perform well in other functional assays

U2OS-Proteasome cells with integrated Cas9 (under CAG promoter) were plated in 96-well plates at 10,000 cells per well. 24h after plating, cells were transfected with 25 nM crRNA:tracrRNA using 0.2 µg/well of DharmaFECT4. Cell were analyzed for apoptosis 48 h after transfection using the ApoONE homogeneous assay (Promega). Shown is a box plot representation of the functionality of crRNAs targeting BCL2L1, PLK1 or WEE1 in ApoONE assay. To generate the box plot, the crRNAs were divided into bottom half (H1) and top half (h2) based on their functional score. The medians, distribution of data between the lower and upper quartile and the minimum and maximum values demonstrate that high-scoring crRNAs have increased functionality.

Edit-R synthetic guide RNA products

Predesigned synthetic sgRNA

Genome wide synthetic sgRNA designs guaranteed to edit your gene of interest. The design algorithm maximizes the potential for functional protein knockout while minimizing off-target editing through stringent specificity checks.

Positive synthetic sgRNA controls and detection primers

Species-specific synthetic sgRNAs targeting well-characterized genes, as well as mismatch detection assay primers, to determine the effectiveness of your gene editing conditions for maximal efficiency.

Synthetic sgRNA non-targeting controls

Non-targeting controls to evaluate cellular responses to CRISPR-Cas9 components in the absence of gene target-specific sgRNA.

Predesigned synthetic crRNA

Guaranteed to edit your target! Algorithm-optimized crRNA for genome-wide coverage of human and mouse genes. Modifications for nuclease resistance improve DNA-free editing.

Positive synthetic crRNA controls and detection primers

Species-specific synthetic crRNAs targeting well-characterized genes, as well as mismatch detection assay primers, to determine the effectiveness of your gene editing conditions for maximal efficiency.

Synthetic crRNA non-targeting controls

Non-targeting controls to evaluate cellular responses to CRISPR-Cas9 components in the absence of gene target-specific crRNA.

TracrRNA

Trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) is synthetic, HPLC-purified, long RNA required for use with Edit-R synthetic crRNA to form the complex that programs Cas9 nuclease. It is modified for nuclease resistance and can be used with modified or unmodified Edit-R crRNA.

CrRNA libraries

Plated pre-defined collections of popular gene families for arrayed knockout screening

Cherry-pick libraries

Have a favorite gene list? Customize and order plates of predesigned guide RNAs for knockout studies in your targets of interest

Edit-R all-in-one lentiviral sgRNA products

All-in-one lentiviral sgRNA

Genome-wide combined Cas9 and sgRNAs for efficient gene knockout & unparalleled specificity available as glycerol stocks and high-titer purified particles.

All-in-one lentiviral sgRNA positive controls and kits

All-in-one lentiviral sgRNA controls to verify DNA double-strand breaks and gene editing efficiencies.

All-in-one lentiviral sgRNA non-targeting controls

All-in-one lentiviral sgRNA constructs bioinformatically designed to not target any gene in human or mouse genomes.

Edit-R Lentiviral sgRNA products

Predesigned lentiviral sgRNA

Guaranteed to edit your target, algorithm-optimized sgRNA for genome-wide coverage of human or mouse genes. Provided as high-titer lentiviral particles or glycerol stocks.

Lentiviral sgRNA positive controls

Species-specific sgRNAs targeting well-characterized genes to determine the effectiveness of your gene editing conditions for maximum efficiency.

Lentiviral sgRNA non-targeting controls

Non-targeting controls to evaluate cellular responses to CRISPR-Cas9 components in the absence of gene-specific sgRNA.

Pooled lentiviral sgRNA libraries

High-titer pooled screening libraries for pre-defined gene sets in human and mouse.

Arrayed lentiviral sgRNA libraries

Arrayed collections of lentiviral sgRNA libraries for high-throughput knockout screening across entire human gene families.

Custom guide RNA design & ordering tools

CRISPR Design Tool

Place a custom guide RNA order, or design and order your own synthetic sgRNA, crRNA, or lentiviral sgRNA with our easy-to-use interface.

Edit-R HDR donor template design, ordering tools & kits

HDR Donor Designer - oligo

Design and order a single-strand DNA donor (&le 150 nt) for insertion, deletion, or other alteration.

HDR Donor Designer - plasmid

Design and order a plasmid DNA donor kit for insertion of a mKate2 or EGFP fluorescent marker, or other a custom insert.

HDR plasmid donor kits

Rapidly and easily assemble a plasmid donor for HDR

HDR plasmid donor components

Quickly and efficiently build a HDR donor plasmid

HDR plasmid donor primers

PCR components for Edit-R Plasmid Donor Kits

The Edit-R predesigned guide RNA guarantee

We guarantee that EVERY predesigned guide RNA will provide successful editing at the target site when delivered as described in the Edit-R technical manuals.

The Edit-R guide RNA guarantee is valid when used with any wild type S. pyogenes Cas9 nuclease, including mRNA, expression plasmid, protein, or stable Cas9 expression, and Edit-R crRNAs must be used with Edit-R tracrRNA for the guarantee to apply.

Analysis of editing of the treated cell population must be shown using a T7EI or Surveyor mismatch detection assay. If successful editing is not observed for a predesigned Edit-R guide RNA while an appropriate side-by-side Edit-R positive control is successful, a one-time replacement of a different predesigned Edit-R guide RNA of the same format and quantity will be provided at no cost.

A replacement will only be approved upon discussion with our Technical Support team.

Successful editing at the DNA level does not always lead to functional gene knockout it is recommended to test multiple guide RNAs to determine the most effective guide RNA for knockout of your target gene.

This guarantee does not extend to any accompanying experimental costs, does not apply to guide RNAs ordered via the CRISPR Design Tool, and will not be extended to the replacement guide RNA.


Teminiai

Pabrėžia

CRISPR is an incredibly useful tool for geneticists and microbiologists. Short for clustered regularly interspaced short palindromic repeats, it sounds intimidating on the basis of name alone. Yet it’s a tool that Annie Taylor—a senior applied and engineering physics major at Cornell University—uses extensively in her research. What she does with CRISPR showcases some of its powers.

“I can write out a nucleotide sequence on my computer, buy a custom-made DNA fragment for that sequence, and use it to program the CRISPR system to target practically any DNA sequence I want with high specificity.” She explains. Hearing how she uses it, it’s easy to imagine that CRISPR has had a tremendous impact in biological research, with applications in countless subdisciplines.

Creating Genetic Circuits to Operate Like Computer Circuits

Taylor conducts her research in Guillaume Lambert’s lab, Applied and Engineering Physics, which focuses on creating genetic circuits in cells—an application of CRISPR in synthetic biology. Genetic circuits are analogous to logic circuits in electrical engineering. Logic circuits are comprised of many logic gates they alter the voltage and current of a system as it passes through them. Similarly to how computers function, genetic circuits may eventually be used to perform complex logic functions in a cell.

Many types of logic gates perform a variety of functions. Taylor is working on a particular type of logic gate known as a NOT gate, or an inverter. The input of the gate is at a high voltage, while the output of the gate is at a low voltage (or vice versa). In electrical engineering, high voltage is represented by one, while low voltage is zero. A one at the input of a NOT gate would produce a zero at the output. The same is true the other way around.

In biological systems, there is no high voltage or low voltage. Instead, one and zero would correspond to high and low protein expression. A one would mean that a certain protein is expressed, while a zero would mean the protein is inactive.

“While the systems and the techniques are biological, a lot of the underlying theories of our work revolve around physics.”

In a cell, protein expression can be easily examined. One can insert marker genes such as the green fluorescent protein (GFP) gene. A cell that is expressing GFP will glow green in ultraviolet light or blue light, so one can tell whether or not GFP is being expressed by simply shining a blue light over the colonies. Taylor inserts these marker genes into a cell by inserting them into a plasmid, a structure that carries genetic information, which is then absorbed and incorporated into bacterial cells. The end result is a colony of cells that glows green in blue light. Taylor then uses the CRISPR system to target this inserted GFP gene.

How CRISPR Works

“The CRISPR system, in nature, is a bacterial immune system. Bacteria are trying to protect themselves from viruses, which are basically sequences of foreign DNA. They have to be able to recognize what genetic information is foreign and what genetic information is their own.”

To do this, bacterial cells produce Cas proteins, which bind to a guide RNA sequence. Then the Cas protein inspects any DNA it encounters. If any sequences on the DNA match with the guide RNA sequence, the Cas protein recognizes it as being foreign DNA and destroys it.

The most commonly used Cas protein for gene editing, Cas9, natively acts to cut DNA at the place where it is identical to the guide RNA sequence, but Cas9 can be modified in many ways. For instance, the Lambert lab often uses dead Cas9—known as dCas9)—which has been modified so that it is catalytically inactive. When it recognizes a DNA sequence, instead of cutting the DNA, dCas9 binds to that sequence and inhibits transcription. The target DNA sequence is not cleaved but becomes unable to express the protein for which it codes.

The power of the CRISPR system lies in the fact that one can modify the 20-base pair guide RNA sequence that the Cas9 protein binds to. If one knows a critical sequence of DNA on a gene of interest, they can create a corresponding guide RNA sequence that will cause the Cas9 protein to target that area of DNA. If it is dCas9 protein, then it will bind to that sequence of DNA and inhibit transcription, the expression of a protein at that site.

Taylor can design a guide RNA sequence that she knows will correspond to a sequence on one of the marker genes she inserts. For example, she can create a sequence of RNA that corresponds to a critical part of the GFP gene. Before she inserts the guide RNA sequence, the bacterial cells will express the GFP gene. Afterward when the dCas9 has bound to the RNA sequence, recognized the corresponding sequence on the DNA, and deactivated it, the colonies will no longer produce GFP and will no longer glow under ultraviolet light.

“There are a variety of Cas proteins,” Taylor explains. “Each Cas protein may have a different guide RNA structures or may deactivate genes in different ways. And while dead Cas9 inhibits transcriptions, there are other ways to modify Cas proteins to activate genes. It gives us control over which genes are expressed in a cell and which are inhibited.”

Creating Genetics Circuits

One of the aims of the Lambert lab is to use this control over gene expression in order to generate a genetic circuit. They want to develop a system in which they can submit certain inputs, and knowing how the logic gates in the cell will interact with the inputs, be able to obtain a predictable result.

Living systems are incredibly complex, however. Having multiple logic gates might cause them to interfere with each other’s function. The Lambert lab is working to understand the limitations of the system. How many logic gates can be inserted until their behavior is no longer predictable and stable? What are the off-target effects of the CRISPR system?

“If you have a genome that is millions or billions of base pairs long, there might be several locations that the Cas protein will unintendedly target, because they match the 20-base pair guide RNA sequence simply by chance,” Taylor says. “This might be disastrous for the cell, or the cell might appear to be unaffected. It just depends on where those off-target sequences are and what they code for.”

The Fusion of Physics and Biology

Taylor appreciates the intersection between sciences, which is the focus of the Lambert lab. She entered Cornell interested in aerospace engineering, yet in her senior year she has found a passion for combining physics and biology. Minoring in biological sciences, Taylor has been able to apply her coursework to her lab work.

“While the systems and the techniques are biological, a lot of the underlying theories of our work revolve around physics,” she says. She hopes to use the gene editing and manipulation tools that she has learned through her work with the Lambert lab in her future research.

CRISPR is both a scary name and a powerful tool, and as Taylor has learned through her work with the Lambert lab, its applications to scientific research are widespread. It has the potential to turn genetic loci into logic gates and cells into circuits, to turn proteins on or off at will, and to inform our growing knowledge of how cells—and life—function.


Our Role in Developing CRISPR/Cas9

We are proud to offer our newest line of CRISPR genome editing tools to the global research community. As the first company to commercially offer targeted genome editing technology nearly ten years ago, no one has more expertise in this field than us. This experience is especially important when it comes to crafting genome editing tools that possess the critical requirements of having specific targeting and robust cutting activity. We provide both in our new CRISPR product line, and now we put our skill into your hands with a quick and simple web-based design platform. Our CRISPR products can be ordered directly through the link below or browse the CRISPR content on this page to learn more about the technology.


Mitosis and Meiosis Part A

Kara L. McKinley , in Methods in Cell Biology , 2018

3.3 Generation of sgRNA-Expressing Plasmids

3.3.1 Considerations for selection of targeting sequences

The sgRNA should target within 100 bp of the insertion site. It can be in either a coding sequence, or in an untranslated region. For an N-terminal tag, either the 5′ UTR can be targeted, or the first coding exon can be targeted if it is desirable to knock out the other allele as described in Section 3.2 . For a C-terminal tag, the 3′ UTR should be targeted. The targeting sequence should be selected to be (1) feasible (i.e., directly upstream of a PAM sequence) and (2) specific (i.e., with maximal number of mismatches to other sequences) as outlined in Section 2.2.2 .

3.3.2 Cloning targeting sequences into transient vectors

To introduce sequences at specified sites, the Cas9, sgRNA, and repair template only need to be temporarily present within the cells to be targeted. Therefore, for this application we will introduce them by transient transfection. We will transfect two plasmids ( Fig. 7 ): one that constitutively expresses both Cas9 and the sgRNA, and one that carries the repair sequence.

For transient expression of Cas9 and the sgRNA, we use the plasmid pX330 from Feng Zhang's laboratory (Addgene #42230). The cloning for pX330 uses the same overhangs as the pLenti-sgRNA/pKM808 plasmids used in Section 2.2.3 . Therefore, the protocol for cloning is the same as in Section 2.2.3 with one important exception: in this case, the plasmid is cut with BbsI, also marketed as Fast Digest BpiI (Thermo Fisher 10569110). We recommend use of the Fast Digest BpiI, as traditional formulations of BbsI are poorly stable at − 20°C.

As described in Section 2.2.2 , the cleavage efficiency of sgRNAs is variable. Therefore, we recommend designing two sgRNAs per target. If tag insertion fails, cleavage efficiency can be validated using T7 endonuclease I or Surveyor assays.