Informacija

Katijoninis lipidų transfekcijos optimizavimas 150 mm indams


Turiu optimizuoti transfekcijos protokolą, kad hela ląstelėse ir hepg2 ląstelėse laikinai išreikščiau plazmidę, koduojančią eyfp chimerą, prijungtą prie Golgi aparato signalinės molekulės c termino), ir gaučiau kuo didesnę išraišką.

Man reikia pakankamai baltymų maždaug 100 wb. Aš sėjau hela ląsteles į 12 150 mm indų. Ir tas pats su hepg2. Aš paruošiau mg plazmidės.

Aš naudoju invitrogenus originalus lipofektamino reagentas; ne 2000, ltx ar bet kas kitas.

Bet kokie pasiūlymai dėl protokolo dėl hela ir hepg2 plazmidės dna ir lipofektamino sukėlė transfekciją tokioje didelėje plokštelėje.

Manau, kad tik padidinimas turėtų veikti, tačiau čia yra keletas spąstų. Pažvelkite į šią lentelę, pavyzdžiui, kai nuo 60 iki 100 mm padidinate maždaug dvigubai didesnį plotą, taigi jūs taip pat padidinsite dvigubai daugiau kultūros. Tačiau kai jūs padidinate nuo 100 iki 150 mm, jūs trigubai padidinate plotą, bet tik du kartus padidinate kultūros tūrį. Dėl to mano išplėtimo transfekcijai skaičiavimai atrodo tikrai netinkami:


Taigi, kiekvienoje patiekalo protokolo eilutėje visas procesas padidinamas atskira verte. 100–150 mm atveju visos vertės padidinamos maždaug 2,76:

a) 152/55 = 2,76, b) 1,52e7/5,5e6 = 2,76, c) | vid. (30,4-45,6)/vid. (11-16,5) | = 2,76

(kaip atsakyta komentaruose)


Anotacija

Čia mes apibūdiname peptido/ne katijoninių lipidų genų tiekimo sistemos, kuri sėkmingai sukuria aukštą genų ekspresijos lygį, kai jis tiekiamas mikroinjekcijomis į vištienos embrionus, apibūdinimą ir optimizavimą. in vivo. Be plazmidinės DNR, tiekimo kompleksą sudarė keturi komponentai: 1) „kondensacinis“ peptidas su hidrofobiniais ir katijoniniais aminorūgščių segmentais; 2) „fuzogeninis“ peptidas su membranos įterpimu ir amfipatiniais sraigtiniais segmentais 3) palyginti trumpas grandinės fosfatidilcholinas (14: 1 cis-9) ir 4) polietilenglikolis, sujungtas su dioleoilfosfatidil -etanolaminu per disulfidinę jungtį. Optimalus kiekvieno komponento kiekis buvo nustatytas matuojant luciferazės reporterio geno ekspresiją po 24 valandų inkubacijos su viščiuko embriono fibroblasto (CEF) ląstelėmis kultūroje. Kai į kompleksus buvo surenkami palyginti nedideli kondensacinio peptido, fuzogeninio peptido ar lipidų kiekiai, norint pasiekti maksimalią genų ekspresiją, reikėjo palyginti didelės komplekso koncentracijos. Padidinus peptido ar lipidų kiekį, norint pasiekti maksimalią ekspresiją, reikėjo mažiau komplekso, tačiau išraiška žymiai sumažėjo, kai buvo pridėta daugiau komplekso. Polietilenglikolio komponentas žymiai padidino genų ekspresiją. Kai kurių preparatų atveju luciferazės aktyvumas CEF ląstelėse per 24 valandas pasiekė 1 × 10 10 santykinių šviesos vienetų per sekundę vienam mg baltymų. Po optimizavimo eksperimentų su CEF ląstelėmis, kompozicijos, kuriose buvo mažas, vidutinis ir didelis kiekis tiekimo sistemos komponentų, buvo surinktos su žalios fluorescencinės baltymų plazmidės DNR, tada mikroinjekcijos į tam tikras vištų embrionų sritis in vivo. Buvo nustatyta, kad tarpinis komponentų kiekis suteikė patikimiausias kompozicijas, skatinančias lokalizuotą genų ekspresiją somitinėse ląstelėse.


[35] - Katijoninė liposomų sukelta RNR transfekcija

Yra du būdai, kaip suprasti genų funkciją: vienas reikalauja „išmušti“ geno funkciją iš ląstelės, o kitas susijęs su geno įvedimu į ląstelę. Yra daugybė metodų, skirtų genetinei medžiagai įvesti į ląsteles. Tai apima paprastas manipuliacijas, tokias kaip didelės molekulinės masės DNR maišymas su kalcio fosfatu, DEAE-dekstranu, polilizinu arba polornitinu. Kiti metodai apima mikroinjekciją, elektroporaciją, protoplastų suliejimą, liposomas, paruoštus viruso apvalkalus ir virusinius vektorius. Įvairų RNR transfekcijos efektyvumą skirtinguose ląstelių tipuose gali lemti skirtingas pernešamumas, neoptimalus lipofektino ir RNR santykis, transliacijos efektyvumas arba pasiuntinio RNR (mRNR) stabilumas. RNR transfekcijos technika gali būti naudojama tiriant įvairius parametrus, turinčius įtakos mRNR transliacijos efektyvumui, tiesiogiai transfekuojant sukurtus mRNR nuorašus in vitro iš DNR konstrukcijų, turinčių specifinių sekų. RNR-lipofektino procedūra turi galimybę transfekuoti įvairius ląstelių tipus. Ši procedūra taip pat gali būti naudojama tiriant įvairių sekos elementų poveikį mRNR stabilumui.


REZULTATAI

Norėdami nustatyti, ar katijoninius lipidų pagrindu pagamintus transfekcijos reagentus būtų galima optimizuoti ar pakeisti, kad būtų pasiektas priimtinas transfekcijos efektyvumas audiniuose visuose embrionuose, pirmiausia nustatėme perspektyviausias reagentų kompozicijas (ty koncentracijas ir krūvio santykius) ląstelių kultūros tyrime, o tada išbandė tuos reagentus kuriant stuburinių embrionus. Buvo išbandytos trys skirtingos reagentų kompozicijos: lipofektaminas, lipofektaminas 2000 ir lipofektaminas, sustiprintas pegiliu.

Pegilinimas

Pegilinimas, polietilenglikolio grandinių prijungimas, yra įprasta technika, naudojama siekiant padidinti kraujotakos laiką in vivo ir biologinį prieinamumą, sumažinant atpažinimą ir klirensą (Caliceti ir Veronese, 2003). PEG (polietilenglikolis), lankstus ir netoksiškas polimeras, sukuria sterilų barjerinį sluoksnį, kuris apsaugo nuo baltymų adsorbcijos, taigi ir terapinio agento inaktyvacijos bei pašalinimo. Be mažų molekulių, pegilinimas parodė didelį pažadą, kai naudojamas makromolekulėse, ypač liposomose, žymiai sulėtindamas opsonizaciją ir klirensą in vivo. Plačiausiai naudojamas liposomų pegilinimo metodas yra lipidų įtraukimas su kovalentiškai prijungtomis PEG molekulėmis į liposominį dvisluoksnį sluoksnį. Savo reagentui mes susintetinome mPEG-SS-DOPE, 5000 molekulinės masės polietilenglikolio, sujungto su lipidu DOPE (dioleoilfosfatidiletanolaminu) per hidrolizuojamą disulfido jungtį. PEG grandinės konjugacija su DOPE, naudojant disulfido kryžminį jungiklį, sukuria pH jautrias liposomas, kuriose PEG grandinė hidrolizuojama nuo lipoplekso paviršiaus žemo pH endosomos aplinkoje. Įrodyta, kad PEG grandinės hidrolizė destabilizuoja endocitozuotas liposomas, o tai savo ruožtu skatina endosomolizę dėl lipido DOPE fuzogeniškumo, didindama liposomos turinio išsiskyrimą į ląstelės citoplazmą (Kirpoten ir kt., 1996).

Mūsų pegiliuotas transfekcijos reagentas yra optimizuota trijų lipidų kompozicija: katijoninis lipidas DOSPA (2,3-dioleloksi-N- [2 (sperminkarboksamido) etil] -N, N-dimetil-1-propanamino trifluoroacetatas), neutralus lipidas DOPE, ir mPEG-SS-DOPE. Lipofektaminas, plačiai naudojamas komercinis transfekcijos reagentas, yra DOSPA ir DOPE 3: 1 (m/m) liposomų kompozicija. DNR/liposomų kompleksai, lipopleksai, susidaro dėl elektrostatinės sąveikos tarp teigiamai įkrautų aminų grupių DOSPA ir neigiamai įkrautų fosfatų grupių ant DNR ribozės. Mes pasirinkome naudoti lipofektamino DOSPA/DOPE preparatą kaip pagrindą mūsų pegiliuotam reagentui, nes jis yra gerai apibūdintas ir gali pasiekti didelį transfekcijos efektyvumą daugelyje ląstelių tipų kultūroje. Tačiau DOSPA/DOPE lipopleksai turi du pagrindinius trūkumus, ribojančius jų gebėjimą transfekuoti ląsteles in vivo: jie neapsaugo nuo opsonizacijos ir pašalinimo iš serumo komponentų, ir jie negali būti labai koncentruoti dėl susidariusių didelių neaktyvių agregatų, susidarančių DNR. Norėdami įveikti šias problemas, į savo reagentų sudėtį pridėjome mPEG-SS-DOPE ir lipopleksėms sudaryti naudojome ploviklio dializės procedūrą.

Pegiliuota Lipoplex formacija

Dauguma komerciškai prieinamų katijoninių liposomų pagrindu pagamintų transfekcijos reagentų naudoja paprastą vieno žingsnio maišymo protokolą su iš anksto suformuotomis katijoninėmis liposomomis ir plazmidės DNR, sudarydamos lipoplekses, kuriose plazmidės DNR yra joniškai susieta su išoriniais liposomų paviršiais. Tačiau išorinis plazmidės DNR prisijungimas prie liposomų palieka DNR galimą degradaciją ir opsonizaciją serumo komponentų dėka. Be to, elektrostatinė sąveika tarp DNR ir lipidų, atsakingų už lipopleksų susidarymą, taip pat sukelia jungimąsi tarp pačių lipopleksų, todėl lipopleksai sudaro didelius agregatus, o tai žymiai sumažina transfekcijos efektyvumą. Norėdami išspręsti šias problemas, mes pasirinkome ploviklio dializės metodą, kad suformuotume lipopleksus, sumažindami plazminės skilimą ir klirensą, taip pat lipopleksų agregaciją. Įrodyta, kad ploviklio dializė efektyviai įterpia plazmidės DNR į mažus, serume stabilius lipopleksus, net ir esant didelei DNR koncentracijai ir dideliam lipidų-plazmidžių krūvio santykiui ((Hofland ir kt., 1996, 1997 Wheeler ir kt., 1999 Tam ir kt. , 2000).

Nejoninis ploviklis oktilglukopiranozidas (OGP) buvo naudojamas tirpinti plazmidinės DNR, lipofektamino ir pegiliuoto lipido mPEG-SS-DOPE mišinį, kaip parodyta 1 paveiksle. tinka mikroinjekcijų eksperimentams. Fiziologiniame buferyje didelės komponentų koncentracijos iškart nusėda ir iškrenta iš tirpalo, nepaisant tirpinančio ploviklio, dėl stipraus elektrostatinio traukos tarp koncentruotos DNR ir DOSPA. Kad būtų išvengta kritulių, į suspensiją ir dializės buferius buvo pridėta didelė druskos koncentracija. Manoma, kad druska veikia kaip chaotropinis agentas, padedantis išlaikyti stabilų DNR/lipidų mišinį tirpale (Hofland ir kt., 1997). Mes nustatėme, kad 3 M NaCl pakako, kad būtų išvengta tiesioginio nusėdimo, sumaišius per mūsų išbandytų reagentų komponentų diapazoną, 1 mg/ml DNR ir D/N santykį 0,5–2. D/N santykis reiškia DOSPA ir nukleotido santykį (mol/mol) mišinyje, matuojant teigiamai įkrautas aminų grupes DOSPA ir neigiamai įkrautas fosfatų grupes DNR ribozės stubure. Reagento komponentai buvo sumaišyti Hepes buferiniame druskos tirpale (HBS) su 3 M NaCl ir 2% OGP ir dializuojami prieš HBS su 3 M NaCl, kad būtų pašalintas ploviklis (1 pav.).

Reagentų komponentai ir lipopleksų susidarymas. Plazmidinė DNR, lipidai DOPE, DOSPA ir mPEG-SS-DOPE sumaišomi kartu esant anijoniniam plovikliui oktilglukopiranozidui (OGP) ir 3 M NaCl. Ploviklis padeda tirpinti ir išsklaidyti lipidus, o didelė druskos koncentracija palengvina elektrostatinę DNR ir katijoninių lipidų sąveiką ir neleidžia kauptis kompleksams. Tada OGP lėtai pašalinamas dializuojant prieš HBS 3M (5 mM HEPES, 3 M NaCl, pH 7,4), susidaro tirpale stabilios DNR turinčios lipopleksės. Galiausiai druskos koncentracija lipoplekso tirpale sumažinama iki fiziologinio lygio, nuosekliai dializuojant nuo HBS 1,5 M, 0,5 M ir 0,15 M NaCl.

Pašalinus ploviklį, lipopleksai buvo stabilūs, vertinant vizualiai pagal skaidrius dializatus, be nuosėdų nė vienoje reagento formoje. Tačiau druskos koncentracija, esant 3 M NaCl, buvo per didelė mikroinjekcijų eksperimentams in vivo. Buferio druskos koncentracija buvo sumažinta iki fiziologinės koncentracijos atliekant keletą dializės etapų prieš mažėjant druskos koncentracijai, kol lipopleksai buvo galutiniame HBS buferyje su 0,15 M NaCl, pH 7,4. Sumažinus druskos koncentraciją, daugelis preparatų tapo nepermatomi ir pieniški, o kai kurios didelės įkrovos santykio/mažo pegilinimo kompozicijos iškrito įvairiais laipsniais, kaip aprašyta toliau.

Ploviklio dializė ir mPEG-SS-DOPE leidžia mums suformuoti lipopleksus, kurie yra stabilūs daug didesnėse koncentracijose, nei įmanoma naudojant nepegiliuotus lipopleksus. Labai koncentruoti, stabilūs lipopleksai yra svarbus tiesioginio įpurškimo eksperimentų aspektas. Mikroinjekcijai į besivystančių embrionų vietas reikia reagento, kuris gali sukelti didelę transgeno ekspresiją iš tūrio nanolitrų diapazone. Dauguma komercinių transfekcijos reagentų yra netinkami mikroinjekcijoms, nes jie neturi mechanizmo, užkertančio kelią elektrostatiniam prisijungimui tarp kompleksuotų lipopleksų, todėl laikui bėgant ir esant didelėms koncentracijoms sudaro agregatus. Lipofektamino ir Lipofectamine 2000 protokoluose reikalaujama specifinės DNR: reagento koncentracijos ir inkubacijos laiko prieš dedant į kultūros ląsteles, paliekant pakankamai laiko efektyviai DNR: reagento kompleksui susidaryti, bet prieš suformuojant neaktyvius lipoplekso agregatus. Laikui bėgant, net ir mažos koncentracijos, tokios kaip rekomenduojamos ląstelių kultūros transfekcijai, sudaro agregatus, kurių negalima veiksmingai transfekuoti (duomenys nerodomi). Įtraukus mPEG-SS-DOPE į DOSPA/DOPE lipopleksų lipidų dvisluoksnį sluoksnį, susilpnėjo agregacijos jėgos ir mes galėjome suformuoti stabilius lipoplekso tirpalus, kurie išlaikė savo transfekcijos efektyvumą net ir po kelių mėnesių esant 4 ° C temperatūrai. Lipopleksams, kurių D/N santykis yra 0,5, reikia mažiausiai 5% mPEG-SS-DOPE, kad būtų išvengta kritulių susidarymo Lipoplexes, kurių D/N santykis yra 1, reikėjo 7,5% mPEG-SS-DOPE, o lipopleksams, kurių įkrovimo santykis yra 2, reikia 12,5 % mPEG-SS-DOPE. Tos lipoplekso kompozicijos, kuriose buvo daug kritulių, nesugebėjo efektyviai transfekuoti kultivuotų ląstelių. Lipopleksai, kurių mPEG-SS-DOPE yra minimalus arba šiek tiek didesnis nei būtina, kad būtų išvengta kritulių, buvo nepermatomi pieniški, o lipopleksai, žymiai didesni už minimalią mPEG-SS-DOPE koncentraciją, buvo aiškūs.

In vitro transfekcijos rezultatai

Daugumos ląstelių išoriniai ląstelių membranos turi nedidelį grynąjį neigiamą krūvį. Katijoniniai lipidai prisijungia prie ląstelės membranos per elektrostatinę sąveiką tarp teigiamai įkrautų aminų grupių ant lipidų ir neigiamų krūvių, esančių ląstelių paviršiuose. Būtina kruopščiai optimizuoti įkrovos santykį, kad būtų užtikrintas maksimalus DNR kapsuliavimas, o lipopleksai išlaiko pakankamai grynojo teigiamo krūvio, kad paskatintų efektyvų ląstelių paviršiaus surišimą. Mes išbandėme kelis skirtingus lipofektamino, lipofektamino 2000 ir pegiliuoto lipofektamino įkrovimo koeficientus, kad jie galėtų kuo mažiau toksiškai transfekuoti viščiukų embrionų fibroblastų (CEF) ląsteles. Transfekcijos buvo atliktos su serumu ir be jo auginimo terpėje, siekiant įvertinti serumo komponentų opsonizacijos poveikį atskiroms reagentų formulėms, tai yra svarbus aspektas kuriant transfekcijos reagentą, skirtą naudoti in vivo.

Naudodami CEF ląstelių kultūros sistemą in vitro, ištyrėme pegilio pridėjimo prie lipofektamino pagrindu pagamintų DOSPA/DOPE lipopleksų poveikį. Nors pegilio pridėjimas prie lipopleksų padeda išvengti kritulių, tikimasi, kad jis taip pat slopins elektrostatinę sąveiką, atsakingą už ląstelių membranos surišimą, sumažindamas transfekcijos efektyvumą. Norint nustatyti, ar yra pegiliuoto reagento preparato, kuris koncentruodamas apsaugo nuo didelių kritulių susidarymo, tačiau vis tiek leidžia pakankamai elektrostatinės sąveikos, kad būtų galima surišti ląstelių membraną, kad būtų pasiektas didelis transfekcijos efektyvumas, buvo suformuota pegiliuotų lipopleksų serija, keičiant tiek D/N santykius, tiek mPEG -SS-DOPE lipidų kiekis, o tada tiriamas transfekcijos efektyvumas (papildomi paveikslai S1-S3, kuriuos galima peržiūrėti adresu http://www.interscience.wiley.com/jpages/1058-8388/suppmat). Veiksmingiems klaidingos išraiškos in vivo eksperimentams reikalingas transfekcijos metodas su minimaliu toksiškumu, siekiant sumažinti ląstelių mirtį ir anomalią endogeninę genetinę išraišką dėl transfekcijos reagento ar metodo. Tikimasi, kad visi transfekcijos metodai turės tam tikrą toksiškumą. Taigi pegiliuotų lipopleksų toksiškumas buvo išmatuotas matuojant bendrą ląstelių baltymą 24 valandas po lipopleksų pridėjimo, kaip ir naudojant Lipofectamine ir Lipofectamine 2000 (papildomi paveikslai S1, S3).

Iš šių rezultatų mes nustatėme, kad D/N = 1, 7,5% mPEG-SS-DOPE yra geriausia pegiliuoto reagento kompozicija. Palyginimui, nubraižytas D/N = 1, 7,5% mPEG-SS-DOPE pegiliuoto lipofektamino transfekcijos efektyvumas ir toksiškumas, kartu su 1: 4 Lipofectamine 2000 transfekcijos efektyvumu ir toksiškumu, esant serumui. Rezultatai (2 pav.) Rodo, kad in vitro optimizuotas pegiliuotas reagentas pasižymi panašiu transfekcijos efektyvumu ir toksiškumu, lyginant su optimizuotu Lipofectamine 2000. Abu reagentai buvo pasirinkti tolesniems in vivo transfekcijos tyrimams. Pegiliuotam reagentui reikia maždaug × 6 didesnės DNR koncentracijos, kad būtų pasiektas toks pat transfekcijos efektyvumas kaip ir Lipofectamine 2000. Tačiau D/N = 1, 7,5% mPEG-SS-DOPE lipopleksų toksiškumas yra mažesnis nei Lipofectamine 2000 lipopleksai (83% viso pegiliuoto lipofektamino baltymų, kurių bendras lipidų kiekis yra 7,5% mPEG-SS-DOPE ir D/N santykis 1: 1, esant 3 μg DNR/duobutei, palyginti su 77% viso baltymo 1: 4 lipofektaminu, esant 0,5% μg DNR/duobutė).

Geriausių reagentų preparatų transfekcijos efektyvumo ir toksiškumo palyginimas: 7,5% mPEG-SS-DOPE pegiliuotas D/N = 1 lipofektaminas (raudonos ir oranžinės spalvos kreivės) ir 1: 4 Lipofectamine 2000 (mėlynos ir žalios kreivės). Transfekcijos efektyvumas buvo matuojamas β-galaktozidazės aktyvumu, o toksiškumas-bendru baltymu, likusia po 24 šulinėlių CEF ląstelių kultūros transfekcijos eksperimentų.

Chick in vivo transfekcijos rezultatai

Hamburgerio ir Hamiltono (HH) 16 stadijos viščiukų embrionai buvo mikroinjekuoti tiek su optimizuota 1: 1 Lipofectamine 2000 reagento kompozicija, tiek su pegiliuotu D/N = 1, 7,5% mPEG-SS-DOPE reagentu, kaip nustatyta transfekcijos in vitro eksperimentuose. Buvo pasirinkti du vartojimo būdai: sisteminės injekcijos ir vietinės injekcijos. Sisteminių injekcijų metu į širdį buvo švirkščiama ~ 2,5 μl lipopleksų, turinčių žalią fluorescencinį baltymą (GFP) ekspresuojančios plazmidės pCX -GFP, o transfekcija buvo įvertinta vizualiai, stebint GFP ekspresiją fluorescenciniu mikroskopu. Lokalizuotoms injekcijoms ~ 100 nl pCX-GFP lipopleksų buvo tiesiogiai įšvirkščiamas į 16 stadijos embrionų nervinį vamzdelį.

1: 1 „Lipofectamine 2000“ reagento kompozicija iš pradžių buvo švirkščiama į besivystančius viščiukų embrionus praskiestos koncentracijos (0,01 mg/ml), rekomenduojamos ląstelių kultūros transfekcijai. Tačiau mes radome labai mažai transfekcijos naudojant šį nekoncentruotą reagentą. Sušvirkštus į nervinį mėgintuvėlį, tik 2 iš 21 embriono parodė fluorescenciją ir fluorescencija buvo matoma tik labai nedaugelyje ląstelių (& lt10). Tada 1: 1 lipofektaminas 2000 buvo sukomplektuotas esant didesnėms koncentracijoms - 0,025 mg/ml ir 0,05 mg/ml, ir buvo tiriamas jų gebėjimas transfekuoti ląsteles in vivo.Mes nustatėme, kad 1: 1 Lipofectamine 2000 formulės koncentracija sukėlė daug geresnę transfekciją nei nekoncentruota 1: 1 Lipofectamine 2000, ypač 0,05 mg/ml koncentracija po sisteminės injekcijos. Tačiau koncentruotas 1: 1 Lipofectamine 2000 veikimo laikas buvo labai trumpas, nes iš tirpalo nusėdo neaktyvūs užpildai. Mes galėjome dirbti su lipopleksėmis tik & lt20 min., Kol buvo matomas didelis kiekis nuosėdų ir pastebimai sumažėjo transfekcijos efektyvumas.

Tada buvo lyginama transfekcija in vivo koncentruotu 1: 1 lipofektamino 2000 reagentu ir 7,5% mPEG-SS-DOPE pegiliuotu, D/N = 1 lipofektamino reagentu. Visų embrionų vaizdų padidinimo ir ekspozicijos laikas buvo pastovus, kad būtų užtikrintas reagentų palyginimo tikslumas. Po sisteminių abiejų reagentų injekcijų (3A – J pav.), Dauguma embrionų parodė GFP ekspresiją kraujagyslėse. Lipofectamine 2000 pagamino GFP ekspresiją 18 iš 19 embrionų, tuo tarpu pegiliuotas lipofektaminas sukėlė GFP ekspresiją 12 iš 12 embrionų. Lipofectamine 2000 pagamino GFP išraišką, kuri paprastai apsiribojo širdimi ir keliomis embriono kraujagyslių ląstelėmis (3F – J pav.). Tačiau pegiliuotas lipofektamino reagentas aiškiai pagamino žymiai stipresnę transfekciją daug platesniu ląstelių skaičiumi visoje kraujagyslėje (3A – E pav.), O ypač širdyje (4I, J, L pav.). Po abiejų reagentų injekcijų į nugaros smegenis (3K – T pav.) 11 iš 12 pegiliuotų lipofektamino embrionų parodė GFP ekspresiją (3K – O pav.), Tačiau tik 4 iš 11 Lipofectamine 2000 injekuotų embrionų parodė GFP ekspresiją (3P pav.). - T). Kaip ir injekcijos į kraujagysles, pegiliuotas lipofektamino reagentas aiškiai sukėlė geriausią in vivo transfekciją nerviniame mėgintuvėlyje, ir daugeliu atvejų buvo didelė GFP ekspresija per visą nugaros smegenų ilgį. Palyginimui, 3K paveikslo intarpas rodo tipišką GFP ekspresiją su elektroporacija po injekcijos į plazminę į nervinį vamzdelį. Išraiška yra plati ir stipri, tačiau apsiriboja sritimi tarp elektrodų.

Viščiukų embrionų transfekcijos in vivo palyginimas tarp optimizuotų pegiliuotų lipopleksų ir optimizuoto Lipofectamine 2000. Palyginimui parodyti penki tipiniai kiekvienos injekcijos embrionai. A – J: In ovo injekcija ∼2,5 µl tūrio koncentruotų lipopleksų, turinčių žalios fluorescencinio baltymo (GFP) ekspresijos vektoriaus pCX-GFP, į Hamburgerio ir Hamiltono (HH) 16 stadijos viščiukų embrionų širdį ir vizualizuota po 24 val. Embrionai, švirkščiami optimizuotais pegiliuotais lipopleksais (A - E), sukėlė žymiai geresnę žaliųjų fluorescencinių baltymų (GFP) ekspresiją nei embrionai, įpurkšti optimizuoto koncentruoto lipofektamino 2000 (F - J). K – T: ∼ 100 nl tūrio koncentruotų lipopleksų, kuriuose yra pCX-GFP, įpurškimas į HH 16 stadijos jauniklių embrionų nugaros smegenis. Optimizuotos pegiliuotos lipopleksės (K - O) sukėlė žymiai geresnę GFP ekspresiją nei embrionai, įpurkšti optimizuoto koncentruoto Lipofectamine 2000 (P - T), kuris sukėlė labai mažai GFP ekspresijos. Įterpta dėžutė K rodo palyginimo tipiško nugaros smegenų elektroporacijos rezultatus.

Viščiukų embriono in vivo žaliai fluorescencinio baltymo (GFP) ekspresija po optimizuoto lipoplekso preparato injekcijų. A-H: Lipopleksai, turintys GFP ekspresuojančią plazmidę pCX-GFP, buvo švirkščiami in ovo į atrinktus 16 stadijos viščiukų embrionų audinius ir po 24 valandų vizualizuojami fluorescencijos (A-D) ir šviesaus lauko mikroskopijos (E-H) pagalba. A – J: Nugaros smegenų injekcija (A, E), šoninės plokštelės mezodermos injekcija (B, F), somito injekcijos (C, G), galvos mezenchimo injekcija (D, H) ir širdis (I, J). K, L: Šios 20 μm parafino sekcijos buvo paimtos 24 valandas po to, kai optimizuota lipoplekso formulė buvo sušvirkšta į nugaros smegenis (K) ir širdį (L). Embrionai buvo nudažyti „Alexa Fluor 488“ anti-GFP antikūnais, o pjūviai buvo vizualizuoti naudojant fluorescencinę mikroskopiją. L: rodyklės rodo GFP teigiamas ląsteles širdies skerspjūvyje.

Ląstelių transfekcija per visą kraujagyslių ilgį yra susijusi su ilgu cirkuliuojančiu lipopleksų pobūdžiu, atsirandančiu pridėjus pegilio. Pegiliuoto lipofektamino reagento gebėjimas transfekuoti lokalizuotus viščiuko embriono regionus buvo toliau tikrinamas įpurškiant kelias skirtingas vietas 16 vystymosi stadijos embrionų (4 pav.). Po injekcijos į nervinio vamzdelio (4A, E pav.), Šoninės plokštelės mezodermos (4B pav., F), somitų (4C pav., G) ir galvos mezenchimos (4D pav.), Buvo pastebėta puiki vietinė transfekcija. H). Pastaruosius tris audinius sunku transfekuoti naudojant elektroporaciją. Anti-GFP antikūnais nuspalvintos pegiliuoto lipofektamino transfekuotų nugaros smegenų sekcijos parodė GFP ekspresiją nervinėse ląstelėse, taip pat nugaros šaknų gangliono ląstelėse, kurios migravo iš nervinio vamzdelio (4K pav.).

Pelės transfekcijos in vivo rezultatai

Norėdami patikrinti pegiliuoto lipofektamino reagento veiksmingumą kitame organizme, pelių embrionai buvo mikroinjekuoti su optimizuota reagento kompozicija. Kaip ir naudojant viščiukų embrionus, buvo naudojami du vartojimo būdai, siekiant įvertinti reagento potencialą klaidingai ekspresuojant pelių embrionus: sisteminės injekcijos ir lokalios injekcijos. Sisteminės injekcijos buvo atliekamos įšvirkščiant ∼1 μl ∼1 mg/ml GFP lipopleksų į kairįjį kultivuojamo embriono dienos (E) širdies įtekėjimo taką (8.5 pelės embrionai) ir transfekcija buvo įvertinta vizualiai fluorescenciniu mikroskopu. Praėjus dvidešimt keturioms valandoms po injekcijos, reikšminga GFP ekspresija buvo matoma visame trynio maišelio (5A pav., C) ir paties embriono kraujagyslėse (5B, D pav.). Nepastebėta jokių defektų ar anomalijų dėl sisteminės transfekcijos reagento injekcijos. Lokalizuota injekcija optimizuoto reagento preparato į kultivuotų E8.5 pelių embrionų perikardo sritį sukėlė stiprią GFP ekspresiją širdyje (5E, F pav.). Be to, lokalizuota injekcija į nervinį vamzdelį E9.5 pelės embrionų sukėlė stiprią GFP ekspresiją, apsiribojančią nerviniu vamzdeliu (5G pav., H).

Pelės embriono in vivo žaliojo fluorescencinio baltymo (GFP) ekspresija po sisteminių ir vietinių optimizuoto lipoplekso preparato injekcijų. REKLAMA: Lipopleksai, turintys GFP ekspresuojančią plazmidę pCX-GFP, buvo švirkščiami į kairįjį embriono dienos (E) 8,5 pelės embriono įtekėjimo taką ir po 24 valandų vizualizuojami fluorescencijos būdu. Rodomi du skirtingi embrionai (A ir B tas pats embrionas, o C ir D tas pats embrionas), abu su trynio maišeliu, vis dar pritvirtintu (A, C), o trynio maišelis pašalintas (B, D). Embrionai parodė fluorescenciją visame kraujagyslėje, įskaitant trynio maišelį (A, B) ir vidinę embrioninę kraujagyslę (C, D). E – H: GFP ekspresija po injekcijos vietoje optimizuoto lipoplekso preparato į pelės E8.5 (E, F) perikardo sritį ir į E9.5 embrionų nervinį vamzdelį (G, H). A ir B paveikslėliuose rodomas tas pats embrionas ir su trynio maišeliu (E), ir su trynio maišeliu (F). G ir H vaizdai rodo tą patį embrioną mažesniu padidinimu (E) ir didesniu padidinimu (H). Embrionai stipriai fluorescuoja tik švirkštuose širdies audiniuose (E, F) ir nerviniame vamzdyje (G, H).


Įvadas

Egzogeninių DNR molekulių pristatymas ląstelėse, siekiant manipuliuoti fiziologinėmis funkcijomis genetiniu lygmeniu, buvo nepakeičiama priemonė tiek molekulinės biologijos tyrimuose, tiek biotechnologijose. Klinikinis genų pristatymo, kaip molekulinės terapijos formos, vertimas buvo lėtas, daugiausia dėl to, kad nėra genų pristatymo vektorių (GDV), kurie galėtų patenkinti tiek efektyvumo, tiek saugos reikalavimus. Išjungti ginkluoti rekombinantiniai virusiniai vektoriai šiuo metu išlieka efektyviausias genų perdavimo būdas. Tačiau imunogeniškumo, liekamojo užkrečiamumo ir įterpimo mutagenezės rizika šiuo metu neleidžia jų plačiai naudoti [1]. Nuolat dedant pastangas kurti nevirusinius GDV, buvo gauta didelė biologiškai suderinamų medžiagų biblioteka, galinti pakankamai pakuoti DNR ir pristatyti ikiklinikinių modelių, tačiau jos dar nepasiekė veiksmingumo, kurį gali sukelti virusiniai vektoriai. Strategijos, skirtos pagerinti katijoninių reagentų, skirtų genų tiekimui, efektyvumą ir biologinį suderinamumą, paprastai apima funkcinių ligandų, tokių kaip peptidai, lipidai, cukrus arba jų derinys, skiepijimą, siekiant pagerinti vektorių stabilumą, taikymą, įsisavinimą ir prekybą ląstelėmis [2] . Šiuo atžvilgiu buvo įrodyta, kad hidrofobinis katijoninių reagentų modifikavimas su lipidų dalimis pagerina membranos surišimą ir padidina genų tiekimo efektyvumą [3]. Mūsų grupė parodė šio metodo įgyvendinamumą, įskiepijus kelis endogeninius lipidus į mažos molekulinės masės (2 kDa) polietileniminą (PEI2). Efektyviausias polimeras, būtent linolo rūgštimi pakeistas PEI2 (PEI2LA), pasižymėjo žymiai padidėjusiu transfekcijos efektyvumu, palyginti su santykinai neefektyvia pirmtako molekule tiek kultivuotose ląstelių linijose, tiek iš audinių gautose pirminėse ląstelėse [4], [5]. Anksčiau parodėme, kad padidėjusį PEI2LA efektyvumą iš dalies lėmė stipresnis ryšys su branduoline membrana, o tai koreliavo su geresniu branduolio įsisavinimu ir vėlesne transgeno ekspresija [5]. Tačiau dar reikia išsiaiškinti konkretų naudojamą įsisavinimo būdą ir vėlesnius prekybos ląstelėse įvykius, kuriuos sukelia PEI2LA.

Tikimasi, kad lipidų pakeitimas pagerins genų tiekimą, skatindamas stipresnį polimero/DNR kompleksų prisijungimą prie plazmos membranos hidrofobinių sričių, kad padidėtų įsisavinimas. Hidrofobinės modifikacijos taip pat gali pakeisti kompleksų fizines ir chemines savybes, todėl gali pasikeisti įsisavinimo keliai. Įsiurbimo keliai yra gyvybiškai svarbūs nustatant GDV efektyvumą, nes tai susiję su vidinių ląstelių apdorojimu, prekyba ir perdirbimu. Manoma, kad surinktų kompleksų įsisavinimas vyksta per endocitozę [6], [7]. Endocitozė yra plačiai suskirstyta į dvi kategorijas: pinocitozę ir fagocitozę, iš kurių pastaroji apsiriboja specializuotais ląstelių tipais, tokiais kaip limfocitai ir makrofagai. Pinocitozė dar skirstoma į nuo klatrino priklausomą endocitozę (CME), caveolino sukeltą endocitozę (CvME), makropinocitozę ir nuo klatrino/caveolino nepriklausomą kelią. Manoma, kad CvME yra įsisavinimo kelias, labiausiai palankus transfekcijai dėl savo nerūgščios, neskaidomos aplinkos, kuri išlaikė nukleorūgščių krovinio vientisumą. Buvo įrodyta, kad CvME yra endocitinis kelias, vedantis į efektyvią transgeno ekspresiją COS-7 ir HeLa ląstelėse PEI tarpininkaujant [8], [9], [10]. Tačiau kiti pasiūlė CME kaip efektyviausią įsisavinimo būdą, nes jis ne tik sudarė rūgščią aplinką PEI kompleksams, palengvinantiems endosomų sutrikimą per protonų kempinės efektą, bet ir palengvino transgeninio krovinio judėjimą arti perinuklearinio regiono, vėliau padidėjo polinkis į branduolinį importą [11]. Tačiau naujausi tyrimai taip pat parodė, kad įsisavinimas per makropinocitozę yra efektyviausias patekimo į PEI25 būdas [12]. Nepriklausomai nuo to, kuris endocitinis kelias yra efektyviausias transfekcijos kelias, nuomonė, kad vienas kelias gali būti optimalus visiems GDV, gali būti nereali. Transfekcijos keliai įvairiuose ląstelių tipuose skiriasi [13], [14] ir greičiausiai priklausys nuo biocheminio GDV pobūdžio ir gautų kompleksų fizikinių ir cheminių savybių [15]. Atsižvelgiant į tai, mechaniniai tyrimai ir tolesnis nevirusinių GDV optimizavimas turėtų būti idealiai ištirti kliniškai reikšmingose ​​pirminėse ląstelių linijose, kad klinikinis vertimas į abi ex vivo ir in vivo pristatymo nustatymus galima supaprastinti. Tai nebuvo ankstesnių tyrimų, kuriuose buvo tiriamas endocitinių takų vaidmuo nevirusinių GDV efektyvumui, atveju, kai įprastai buvo naudojamos transformuotos ląstelių linijos [8], [9], [13], [14], [16], [17], [18].

Šiame tyrime mes panaudojome normalias žmogaus apyvarpės fibroblastų (NHFF) ląsteles, kad išsiaiškintume ląstelių patekimo ir prekybos polimeriniais GDV mechanizmą. Šiuo atžvilgiu NHFF ląstelė yra universali platforma, nes ji turi klinikinę reikšmę tiek gydant ląsteles pluripotentinių ląstelių indukcijai, tiek odos genų terapijoje odos regeneracijai ir žaizdų taisymui [19], [20], [21], [ 22]. Mes siekėme nustatyti vyraujantį endocitinį kelią, susijusį su PEI2LA kompleksų įsisavinimu NHFF ląstelėse, palyginti su vietiniais PEI (PEI2 ir PEI25). Mes taikėme daugybę farmakologinių inhibitorių, kurie selektyviai slopino CME, CvME ir makropinocitozę, kad sumažintume įsisavinimo kelią. Konkreti inhibitorių veikla buvo apibrėžta titruojant vaisto koncentraciją pagal ląstelių gyvybingumą ir transfekcijos efektyvumą. Toliau ištyrėme kompleksų pasiskirstymą ląstelėse ir endosomų išsiskyrimo, kaip greitį ribojančio žingsnio, vaidmenį bendroje transfekcijoje. Iš šio tyrimo padarytos išvados ne tik suteiks mechanistinę įžvalgą apie lipidų dalių poveikį prekiaujant GDV, bet ir turės tiesioginės įtakos būsimam polimerinių GDV, skirtų terapiniam genų pristatymui į NHFF ląsteles, dizainui.


Stabili transfekcija

Stabiliai transfekuotų ląstelių pasirinkimas

Stabilios transfekcijos optimizavimas prasideda nuo sėkmingos trumpalaikės transfekcijos. Tačiau ląstelės turėtų būti transfekuotos plazmida, kurioje yra atsparumo vaistams genas, pvz., Neomicino fosfotransferazė (neo). Kaip neigiamą kontrolę, transfekuokite ląsteles naudodami DNR, kurioje nėra atsparumo vaistams žymeklio.

  1. Prieš transfekciją nustatykite selektyvią vaisto koncentraciją, reikalingą neinfekuotoms ląstelėms naikinti.
  2. Praėjus keturiasdešimt aštuonioms valandoms po transfekcijos, trippsinizuokite prilipusias ląsteles ir perpilkite keliais skirtingais praskiedimais (pvz., 1: 100, 1: 500) į terpę, kurioje yra atitinkamas atrankos vaistas. Kad selekcija būtų veiksminga, ląstelės turėtų būti nepakankamai susiliejusios, nes susiliejusios, neaugančios ląstelės yra atsparios antibiotikų, tokių kaip G-418, poveikiui.
  3. Kitas 14 dienų vaistą turinčią terpę keiskite kas 3–4 dienas.
  4. Antrąją savaitę stebėkite ląsteles, ar nėra skirtingų išlikusių ląstelių „salų“. Vaistams atsparūs klonai gali atsirasti per 2–5 savaites, priklausomai nuo ląstelių tipo. Ląstelių mirtis turėtų įvykti po 3–9 dienų kultūrose, transfekuotose neigiama kontroline plazmida.
  5. Standartiniais metodais (pvz., Naudojant klonavimo cilindrus) atskirus klonus perkelkite į 96 šulinėlių plokšteles ir toliau laikykite kultūras terpėje, kurioje yra atitinkamas vaistas.

4 lentelėje pateikiama dažniausiai naudojamų antibiotikų, skirtų atrinkti ir išlaikyti stabilius transfektantus, apžvalga.

4 lentelė. Antibiotikai, naudojami stabiliems transfektantams parinkti.

Antibiotikas Pasipriešinimo genas Darbinė koncentracija Akcijų sprendimas
G-418 arba Geneticin® aminoglikozido (pvz., neomicino) fosfotransferazės G-418 dažnai naudojamas pradiniam pasirinkimui esant 500 μg/ml, esant 50–1 000 μg/ml diapazonui 50 mg/ml vandenyje arba 100 mM HEPES (pH 7,3), pastarasis buferis padeda išlaikyti auginimo terpės pH
Higromicinas (Hygro) hph 10–400 µg/ml 100 mg/ml vandenyje
Puromicinas (Puro) pak 1–10 µg/ml 10 mg/ml vandenyje arba HEPES buferiniame tirpale (pH 7,0)

Stabilaus transfekcijos efektyvumo apskaičiavimas

Norint nustatyti gautų stabilių transfektantų procentą, galima naudoti šią procedūrą.

Pastaba: Po šios procedūros dažytos ląstelės nebebus gyvybingos.


Įvadas

Nuo tada, kai buvo rasta beveik prieš 30 metų 1, antisense technologija buvo plačiai naudojama kaip tyrimo priemonė, skirta specifinei sekos genų nutildymui, siekiant išsiaiškinti genų funkciją ir patvirtinti vaistų tikslą 2, ir šiuo metu ji taip pat kuriama klinikiniam pritaikymui 3, 4. Teoriškai antisense technologijos koncepcija yra elegantiška. Trumpi sintetiniai oligodeoksinukleotidai (ODN) selektyviai jungiasi prie papildomo tikslinio geno mRNR nuorašo per Watson-Crick hibridizaciją, taip slopindami mRNR transliaciją į atitinkamą baltymą per bet kurį iš kelių mechanizmų, tokių kaip transliacijos sustabdymas arba mRNR skilimas ribonukleazės H 5 pagalba. Tačiau praktinis antisense oligonukleotidų pritaikymas pasirodė esąs sudėtingas, daugiausia dėl jų jautrumo skaidymui ląstelių nukleazėse ir dėl to, kad sunku pateikti efektyvias ir saugias dozes. Siekiant padidinti jų stabilumą prieš nukleolitinį skilimą, taip pat padidinti jų afinitetą taikiniui ir sumažinti jų toksiškumą, buvo susintetinti antisense oligonukleotidai su įvairiais cheminiais pakeitimais. Tai, be kita ko, fosforotioato ODN, metilfosfonatai ir fosforamidato ODN, 2 ir#x02032-O-modifikuota RNR, užrakintos nukleorūgštys ir peptidinės nukleorūgštys 3, 6, 7. Dar viena ilgalaikė problema, susijusi su antisense oligonukleotidų tiekimu į ląsteles ir audinius. Buvo sukurtos įvairios nevirusinės oligonukleotidų tiekimo sistemos, skirtos keliems kriterijams, tokiems kaip geresnis stabilumas fiziologinėmis sąlygomis, efektyvus tikslinių ląstelių internalizavimas, atsparumas ląstelinėms nukleazėms ir sumažinta nespecifinė sąveika su kitomis makromolekulėmis. Nepaisant daugybės tyrimų šioje srityje, pristatymo efektyvumas ir specifiškumas daugeliu atvejų dar nėra patenkinami 8.

Daugumos oligonukleotidų tiekimo sistemų pagrindinis komponentas yra sintetinis polimeras arba lipidas (arba lipidų mišinys). Katijoniniai lipidai, dažniausiai naudojami plazmidėms, turinčioms terapinius genus, tiekti, taip pat yra perspektyvūs reagentai oligonukleotidams tiekti. 9, 10 Katijoniniai lipidų/DNR kompleksai paprastai formuojami naudojant teigiamo krūvio perteklių (kurį sukelia lipidų komponentas), taip suteikdami efektyvesnę dalelių sąveiką su neigiamai įkrauta ląstelių membrana. Po ląstelių internalizavimo endosomos parūgštėja ir pereina į lizosomas, kur jų turinys pablogėja. Todėl esminis antisense sumažėjimo reguliavimo sėkmės veiksnys yra veiksmingas oligonukleotidų išsiskyrimas iš šio endosominio-lizosominio kelio į citoplazmą 11. Atsižvelgiant į tai, kai kurie sintetiniai vektoriai yra suformuoti su endosominėmis pabėgimo dalimis (pH jautriomis cheminėmis grupėmis), kurios skatina membranos sutrikimą ir DNR išsiskyrimą iš endosomos į citoplazmą. Vienas iš būdų yra neutralaus fosfolipido, pvz., Dioleilfosfatidil -etanolamino (DOPE), kuris patiria dvisluoksnį destabilizavimą esant žemesniam endocitinio skyriaus pH (5–6), sujungimui su endosomine membrana ir destabilizuoja endosomą, taip išlaisvinant DNR krovinį. į citoplazmą. 12 Sintetiniai, į pH reaguojantys amfipatiniai peptidai, tokie kaip GALA ir JTS-1, buvo sukurti kaip pagalbinių lipidų metodo 13, 14 alternatyvos.

Ankstesni tyrimai parodė, kad neigiamai įkrautų serumo komponentų prisijungimas prie teigiamai įkrautų DNR kompleksų gali žymiai sumažinti transfekcijos efektyvumą 15, 16. Siekiant sumažinti arba pakeisti bendrą dalelių krūvį ir taip sumažinti serumo opsonizaciją, anijoniniai polimerai buvo naudojami kaip papildomas 17–19 tiekimo vektoriaus komponentas. Anksčiau buvo įrodyta, kad sintetinis anijoninis polimeras, poli (propilakrilo rūgštis) (PPAA), net ir esant iki 50% serumo, galėjo pagerinti plazmidinės DNR tiekimą ląstelėse per komerciškai prieinamą katijoninę liposomą DOTAP. PPAA buvimas taip pat padidino plazminių, koduojančių antisensinę RNR, transfekciją pelės modelyje 20. Nors buvo parodytas geresnis plazmidžių tiekimas, derinant PPAA su DOTAP, ši sistema anksčiau nebuvo tiriama, atsižvelgiant į oligonukleotidų tiekimą. Nepaisant didelių skirtumų tarp plazmidinės DNR ir oligonukleotidų molekulinės masės ir topologijos, kiekviena DNR rūšis elektrostatiškai sąveikauja su DOTAP 14, 15. Mes iškėlėme hipotezę, kad PPAA įtraukimas į formulę suteiks galimybę pagerinti katijoninį liposomų sukeltą oligonukleotidų tiekimą. Norėdami išspręsti šį klausimą, mes pranešame apie fizines ir chemines DOTAP/ODN kompleksų charakteristikas, apimančias laipsniškas PPAA apkrovas (ty sukeldamas įvairius įkrovos santykius), jų ląstelių įsisavinimą CHO ląstelėse ir jų antisense slopinimą modelinėje sistemoje, kurią sudaro stabiliai ekspresuojančios CHO ląstelės pd1EGFP.


REZULTATAI

SAINT-2 𠄽OPE (1: 1) efektyviai tarpininkauja antisense S-ODN įsisavinimui beveik netoksišku būdu

Ankstesniame darbe mes parodėme, kad SAINT-2 𠄽OPE (molinis santykis 1: 1), sujungtas su plazmidės DNR, veiksmingai transfekuoja eukariotines ląsteles (13). Iš tikrųjų transfekcijos efektyvumas iki 90 ir#x00025 pasiekiamas esant maždaug 2,5 (10 ir#x0201320 ir#x000b5M lipidų ir#x0002f1 ir#x000b5g DNR) įkrovimo santykiui (+ / –). Todėl kitas tikslas buvo ištirti, ar SAINT-2 𠄽OPE gali panašiai perkelti antisense ODN į ląsteles, kad būtų galima reguliuoti genų ekspresiją terapiniais ar ląstelių biologiniais tikslais. Naudodami fluorescenciniu būdu pažymėtus ODN, mes nustatėme, kad 㺕 % iš pridėtų ODN visomis šiame tyrime aprašytomis sąlygomis, susietomis su SAINT-2 𠄽OPE pūslelėmis, paruoštomis taip, kaip aprašyta medžiagose ir metoduose, taip sukeldamos efektyvumą lipoplekso mazgas (nerodomas). Siekiant nustatyti optimalų SAINT-2 𠄽OPE ir S-ODN santykį, atsižvelgiant į ODN pristatymo efektyvumą, CHO ląstelės buvo apdorotos arba 20 ir#x000b5M SAINT-2 𠄽OPE, sujungtos su įvairiomis FITC pažymėtų S- ODN arba kompleksas, sudarytas iš 100 nM S-ODN ir įvairių koncentracijų SAINT-2 𠄽OPE. Apdorotos ląstelės buvo surinktos po 4 valandų inkubacijos laikotarpio, o S-ODN pristatymas pagal efektyvumą ir ląstelių, kuriose buvo internalizuotas kompleksas, skaičių buvo išmatuotas FACS. Kaip parodyta fig. Taigi, esant ODN koncentracijai 80 � nM, iš esmės visos ląstelės parodė kompleksą. Priešingai, pridedant kompleksus prie ląstelių ir#x000a0 identiškomis sąlygomis, surinktas iš įvairių  SAINT-2 𠄽OPE kiekių ir fiksuotos S-ODN koncentracijos 򠄀  nM, tolesnis absoliutaus tiekimo padidėjimas nebuvo pasiektas, palyginti su gautu. 100 nM ODN ⼠ µM SAINT-2 𠄽OPE (​ pav. (1B pav.). 1 B). Todėl pastaroji kompozicija buvo naudojama šiame tyrime, siekiant toliau ištirti mechanizmą ir apibrėžti antisense pristatymo efektyvumą. Norėdami įvertinti dabartinės sistemos pristatymo pajėgumų efektyvumą, pirmiausia ištyrėme nesudėtingo S-ODN įsisavinimą ląstelėse ir serumo poveikį. Šiuo tikslu ląstelės buvo inkubuojamos tik su S-ODN arba S-ODN –SAINT-2 𠄽OPE kompleksu 24 valandas įvairiomis sąlygomis, o ląstelių įsisavinimas buvo nustatytas matuojant bendrą su ląstelėmis susijusią fluorescenciją, naudojant fluorescenciniu būdu pažymėtą S- ODN. Kaip parodyta ​ pav. 1C, 1 C, SAINT-2 𠄽OPE padidino S-ODN ląstelių įsisavinimą 100 ir#x02013250 kartų, palyginti su vien tik S-ODN įsisavinimu. Įdomu tai, kad absoliutus įsisavinimo kiekis, kurį atspindi bendra su ląstelėmis susijusi fluorescencija, padidėjo 𢏁,5 karto, esant 10 ir#x00025 FCS. Tačiau atminkite, kad bet kuriuo atveju iš esmės visos ląstelės parodė su ląstelėmis susijusią fluorescenciją.

Parametrų optimizavimas SAINT-2 ir#x02013DOPE sukeltam antisense S-ODN pristatymui į ląsteles. Lipopleksai, turintys 5 ′ fluoresceinu pažymėtą S-ODN arba nesudėtingą ODN, buvo inkubuojami su ląstelėmis, kaip aprašyta medžiagose ir metoduose, o su ląstelėmis susijusių antisensų kiekis buvo nustatytas FACS matavimais. (A) Su ląstelėmis susijęs fluorescencijos intensyvumas (juostos, kairėje y-ašis) ir fluorescenciniu būdu pažymėtų ląstelių procentas (linija, dešinė) y-axis), kaip antisense ODN, susieto su 20 µM SAINT-2 𠄽OPE, koncentracijos funkcija (1: 1). (B) ODN (100 nM) susiejimas kaip SAINT-2 ir#x02013DOPE koncentracijos funkcija. Ląstelių, kuriose buvo su ląstelėmis susijusių lipopleksų, skaičius nurodomas linija (dešinėje) y-ašis). (C) CHO ląstelės buvo gydomos vien tik S-ODN (AS), arba kai jos buvo sujungtos su SAINT-2 𠄽OPE (AS ir#x0002b SD), dalyvaujant (šešėlinės juostos) arba be serumo (užpildytos juostos). Linija rodo ląstelių, pažymėtų kiekvienoje populiacijoje, skaičių įvairiomis nurodytomis sąlygomis. Atkreipkite dėmesį, kad kompleksas su SAINT-2 𠄽OPE (100 nM ⼠ ir#x000b5M lipidų) S-ODN tiekimą padidina 100 ir#x02013250 kartų, o sudėtingas įsisavinimas esant serumui yra geresnis. Duomenys yra trijų nustatymų vidutinės vertės (±SD).

Tiek sintetinių amfifilų naudojimas, tiek gydymas antisense ODN dažnai patyrė rimtą citotoksinį šalutinį poveikį. Nors mūsų ankstesnis darbas (13, 17, 18) aiškiai reiškė santykinį netoksišką SAINT amfifilo pobūdį, palyginti su kitais katijoniniais lipidais, toliau patikrinome galimą jo toksiškumą kartu su ODN taikymu. CHO ląstelės buvo inkubuojamos tik su 20 µM SAINT-2 𠄽OPE, vien tik su 100  nM antisense S-ODN arba ODN – amfifilio kompleksu, esant arba nesant 10 % serumo. Po 24 valandų ląstelės buvo surinktos ir citotoksiškumas nustatytas MTT tyrimu. Kaip parodyta 2 paveiksle ir 2 paveiksle, ląstelės, apdorotos antisense S-ODN, neparodė jokio citotoksiškumo. Ląstelės, apdorotos vien SAINT-2 𠄽OPE, ir SAINT-2 𠄽OPE ir S-ODN kompleksas parodė tik nedidelį citotoksiškumą, kuris buvo 㰐 % esant serumui. Todėl darome išvadą, kad esant tinkamam moliniam santykiui SAINT-2 𠄽OPE (20 µM) efektyviai pristato ODN (100 nM) į ląsteles, todėl beveik visos toksiškos kultūros sistemos ląstelės įsisavina beveik netoksiškai būdu, kurį skatina, o ne slopina (10 ir#x00025) serumas. Siekiant toliau apibrėžti įsisavinimo parametrus, internalizavimo mechanizmą ir iš to kylantį biologinį poveikį, buvo atlikti kiti eksperimentai.

Antisense gydymas ir toksiškumas ląstelėms. CHO ląstelės buvo inkubuojamos 24 valandas arba esant (užtemdytoms juostoms), arba be 10 ir#x00025 serumo (užpildytos juostos). Toksiškumas buvo nustatytas naudojant MTT tyrimą, o duomenys išreiškiami išgyvenusių ląstelių procentine dalimi, palyginti su neapdorotomis CHO ląstelėmis (100 ir#x00025). Vidutinės vertės ir#x000b1 SD buvo gautos iš dviejų ar trijų eksperimentų, atliktų dviem egzemplioriais.

SAINT-2 sukeltas S-ODN įsisavinimas priklauso nuo laiko ir jį skatina serumas

Norint nustatyti amfifilų ir#x02013ODN komplekso įsisavinimo ląstelėse kinetiką, ląstelės buvo inkubuojamos su FITC pažymėtu antisense S-ODN kompleksu, paruoštu CHO terpėje (žr. Medžiagos ir metodai), esant serumui arba jo nesant. Po įvairių laiko intervalų ląstelės buvo surinktos ir su ląstelėmis susijusi fluorescencija buvo nustatyta FACS matavimais. Kaip parodyta 3 pav. Po šio laiko intervalo tolesnis padidėjimas per ateinančias 12 valandų buvo tik nedidelis ir sudarė papildomą � � % viso suvartojimo. Įdomu tai, kad, kaip jau minėta aukščiau, įsisavinimo efektyvumas gali būti padidintas, kai ląstelės buvo inkubuojamos su kompleksu, esant 10 ir#x00025 serumui, skirtumas tarp abiejų sąlygų tapo ryškiausias po 4 valandų inkubacijos. Taip pat svarbu pažymėti, kad per visą inkubacinį laikotarpį visos ląstelės turi gebėjimą įsisavinti kompleksą, net ir po 1 valandos, visos populiacijos ląstelės turi su ląstelėmis susijusią fluorescenciją ir, be to, šiam įsisavinimui įtakos neturi serumo buvimas.

S-ODN įsisavinimo kinetika ir serumo poveikis. Ląstelės buvo inkubuojamos su FITC pažymėtais S-ODN –SAINT-2 ir#x02013DOPE kompleksais nurodytus laiko intervalus, esant serumui arba jo nebuvus. Po plataus plovimo ląstelės buvo surinktos ir su ląstelėmis susijusi fluorescencija (užpildytos juostos be serumo tamsintų juostų, esant serumui) ir fluorescenciniu būdu pažymėtų ląstelių skaičius populiacijoje (trikampiai ir kryžiai, serumo buvimas ir nebuvimas, atitinkamai) buvo išmatuoti FACS. Rezultatai yra trijų skirtingų eksperimentų, atliktų dviem egzemplioriais, vidurkiai ir#x000b1SD.

Iki šiol mes atlikome savo tyrimus naudodami S-ODN, tikėdamiesi galimo ODN degradacijos sukelto degradacijos. Siekiant racionalizuoti jo naudojimą, buvo įdomu ištirti, ar ląstelės skirtingai apdorojo D-ODN pristatymą, naudojant dabartinę nešiklio sistemą. Kaip parodyta 4 paveiksle ir 4 paveiksle, atrodo, kad taip yra. Nors su ląstelėmis susijusi tioliuoto ODN dalis nuolat didėjo priklausomai nuo inkubacijos laiko, su ląstelėmis susijusi D-ODN frakcija, nors ir padidėjo, kai per pirmąsias 4 inkubacijos valandas kinetika buvo gana panaši, kaip ir S-ODN, greitai sumažėjo per kitas 8 inkubacijos valandas. Šie duomenys reiškia, kad didžioji ODN dalis susiduria su mechanizmu, kuris turi apimti skaidymą prieš ląstelių išsiuntimą per 4 ir 12 valandų nuo inkubacijos pradžios. Norėdami toliau tirti ląstelinį apdorojimą, vėliau nustatėme su ląstelėmis susijusių kompleksų (intra) ląstelių lokalizaciją konfokalinio lazerinio skenavimo mikroskopu, naudojant fluorescenciniu būdu pažymėtą S-ODN, o pats nešiklis buvo pažymėtas nekeičiamu lipidų zondu N-Rh-PE (19).

D-ODN ir S-ODN apdorojimo kinetikos palyginimas CHO ląstelėse. CHO ląstelės buvo inkubuojamos su FITC pažymėtais S-ODN arba Cy5 pažymėtais D-ODN, kurie buvo kompleksuoti su SAINT-2 ir#x02013DOPE. Ląstelės buvo inkubuojamos su šiais kompleksais 37 ir#x000b0C temperatūroje įvairius laikus, o su ląstelėmis susijusi fluorescencija buvo matuojama FACS. Su ląstelėmis susijusių S-ODN kiekis nuolat didėjo per 24 valandų inkubaciją (tamsintos juostos). Tačiau su ląstelėmis susiję D-ODN padidėjo tik laikinai, o su ląstelėmis susijusi dalis vėl sumažėjo po 4 valandų inkubacijos. Rezultatai yra trijų nustatymų vidurkiai ir#x000b1SD.

Serumo buvimas neturi įtakos efektyviai S-ODN branduolinei lokalizacijai

CHO ląstelės buvo inkubuojamos su fluorescenciniu būdu pažymėtu (S-ODN ir lipidų) kompleksu, paruoštu CHO terpėje, 3 ir#x000a0h 37 ir#x000b0C temperatūroje, esant serumui arba jo nebuvus. Po šio laiko intervalo buvo pridėta serumo turinti terpė, o ląstelės toliau inkubuojamos 37 ° C ir#x000b0C temperatūroje. Po 21 valandos ląstelės buvo plačiai plaunamos ir ištirtos tiesiogiai arba po fiksacijos 2,5 ir#x00025 paraformaldehidu, atliekant konfokalinę lazerinę skenavimo mikroskopiją (​ pav. (5 pav.). 5). Duomenys atskleidžia, kad nepriklausomai nuo serumo buvimo inkubacinėje terpėje (pradinės 3 valandos), iš esmės visose ląstelėse yra fluorescencija, kuri daugiausia yra lokalizuota branduoliuose. Esant serumui labai mažai, jei ląstelės periferijoje kaupiasi fluorescencija (tai būtų matoma kaip nevienalytė fluorescencija), o tai reiškia, kad dauguma su ląstelėmis susijusios fluorescencijos buvo internalizuotos ląstelėse. Įrašytas raudonai N-Rh-PE, žymintis lipidų nešiklį, gali būti įvardijamas kaip smulkiai taškinė fluorescencija, kuri pirmiausia lokalizuojasi perinukleariniuose regionuose. Kartais pastebima lipidų ir ODN tam tikra kolokalizacija (kaip atspindi geltona spalva). Atkreipkite dėmesį, kad iš šonų išsisklaidžiusi membrana dažosi N-Rh-PE neaptinkamas. Perinuklearinė lokalizacija atspindi nešiklio buvimą endosominiame ir#x02013 lizosominiame kelyje, kaip rodo ryški lizosominio žymens FITC-dekstrano (žalia) kolokalizacija (geltona), internalizuota per 12 val. N-Rh žymėti (raudoni) kompleksai, internalizuoti vėlesniam 4 valandų laikotarpiui (​ pav. (5C pav.). 5 C). Palyginti su jo pasiskirstymu esant serumui, netaisyklingesnė išvaizda N-Rh-PE fluorescencija stebima nesant serumo (​ pav. (5A pav.). 5 A). Taigi, priešingai nei smulkiai taškinė išvaizda jo akivaizdoje, nesant serumo, matomos didelės grupės, kurios dažnai yra lokalizuotos ląstelių periferijoje, tikriausiai atspindinčios ląstelių nesugebėjimą internalizuoti tokius kompleksus. Laikantis šios sąvokos, absoliutus kompleksų įsisavinimas, kai nėra serumo, yra mažesnis nei esant jo koncentracijai (​ pav. (3 pav.). 3). Akivaizdu, kad šis sumažėjimas neturi įtakos galutiniam internalizuotų S-ODN likimui, nes jo branduolinė lokalizacija bent jau kokybine prasme yra tokia ryški, kaip pastebėta esant serumui (​ pav. (5A pav. 5A) palyginti su B). Galiausiai, kai nekompleksuotas fluorescenciniu būdu pažymėtas S-ODN buvo inkubuojamas panašiomis sąlygomis, retkarčiais fluorescencinis taškas citoplazmoje buvo pastebėtas υ ir#x00025 ląstelėse. Nė viena iš šių sąlygų fluorescencija nebuvo lokalizuota branduolys (nerodomas).

Konfokaliniai mikroskopiniai S-ODN įsisavinimo ir pasiskirstymo modelių vaizdai, tarpininkaujant SAINT-2 ir#x02013DOPE. CHO ląstelės buvo inkubuojamos su kompleksais, paruoštais iš FITC pažymėto S-ODN ir SAINT-2 𠄽OPE, pažymėto 1 mol % N-Rh-DOPE, esant 37 ir#x000b0C temperatūrai 24 valandas, esant 10 ir#x00025 serumui. Vaizdai rodo gyvų ląstelių laukus, kuriuose S-ODN yra vaizduojami žaliai, o SAINT-2 ir#x02013DOPE transporto priemonės-raudonai. (A) ODN ir nešiklio pasiskirstymas po inkubacijos be serumo. Atkreipkite dėmesį į S-ODN buvimą ląstelių branduoliuose (žalia), o SAINT-2 ir#x02013DOPE citoplazmoje ir ląstelės paviršiuje buvo kaip dideli, nevienalyčiai taškai (raudoni). (B) Ląstelės buvo inkubuojamos su kompleksais, paruoštais kaip (A), esant serumui. S-ODN buvo lokalizuoti ląstelių branduoliuose (žalios spalvos), tuo tarpu SAINT-2 ir#x02013DOPE nešiklis citoplazmoje buvo vertinamas kaip santykinai maži ir vienodi taškai (raudoni), todėl pasiskirstė smulkiai. Atkreipkite dėmesį, kad tiek (A), tiek (B) tik kartais matomi geltoni taškai, atspindintys fluorescencinio ODN ir lipidų kolokalizaciją. Raudonai pažymėto nešiklio lipido (A ir B) perinuklearinė lokalizacija greičiausiai atsirado dėl nešiklio buvimo endosominiame ir#x02013lysosominiame kelyje. Kai ląstelės buvo inkubuojamos 12 valandų su lizosominiu žymekliu FITC-dekstranu (žalia), po to 4 valandas inkubuojama su S-ODN kompleksais (nepažymėtomis) ir N-Rh-PE –SAINT-2 𠄽OPE (raudona, kai nėra serumo), buvo pastebimas ryškus lizosominio žymens ir SAINT-2 𠄽OPE kolokalizacija, kaip rodo geltona fluorescencija (C). (D) Kai kompleksai buvo paruošti dalyvaujant 10 % serumui, ląstelėse buvo matyti tik nesiskyrę kompleksai, ką atspindi beveik išskirtinė geltonos fluorescencijos išvaizda.

ODN lokalizaciją veikia tik į lipopleksą prasiskverbiantys serumo baltymai

Aukščiau pateikti duomenys parodė, kad serumo buvimas tarpląstelinėje terpėje gali turėti didelės įtakos komplekso dydžiui ir atitinkamai komplekso internalizavimo efektyvumui. Be to, gali būti, kad serumo baltymai gali skirtingai įsiskverbti į kompleksą, taip paveikdami komplekso stabilumą ir, atitinkamai, ODN išsiskyrimą. Tiek kompleksinis internalizavimas, tiek ODN išleidimas iš komplekso greičiausiai yra svarbūs parametrai, reguliuojantys galimą antisense efektą. Šių tyrimų metu pastebėjome, kad priklausomai nuo paruošimo metodikos galima gauti skirtingų dydžių lipopleksų, kaip nurodyta medžiagose ir metoduose (žr. Skyrių „SAINT-2 𠄽OPE 𠄺ntisense“ kompleksų paruošimas). Taigi, paruošus CHO terpėje be serumo, buvo gauti kompleksai, kurių skersmuo iki 1000 nm, kaip nustatyta dalelių dydžio analize. Kai tokie kompleksai buvo sumaišyti terpėje, kurioje yra serumo per 20 minučių po paruošimo, kompleksų dydis buvo � nm. Įdomu tai, kad kai ODN ir#x02013lipidų komplekso surinkimas buvo atliktas buferyje (0,9 % NaCl ir#x0002f10 mM HEPES), buvo gautos dalelės, kurių skersmuo tik 80 nm. Priešingai, kai sudėtingam surinkimui buferis buvo pakeistas serumo turinčia CHO terpe, taip imituojant galimą serumo baltymų įsiskverbimą į lipidų šerdį, kompleksų dydis buvo � � nm. Svarbu tai, kad esant bet kokioms sąlygoms, lipopleksai buvo veiksmingai surinkti, apimant 㺕 ir#x00025 pridėtą ODN (nerodoma). Pridedant prie ląstelių ir tiriant kompleksų ląstelių lokalizaciją, ty kaip paruoštą CHO terpėje, NaCl –HEPES buferyje arba serume esančioje CHO terpėje, buvo pastebėta, kad visais atvejais, išskyrus vieną, buvo matoma branduolinė fluorescencija, ir savo išvaizda iš esmės nesiskiria nuo duomenų, pavaizduotų ​ pav. 5A 5 A ir B. Išimtis buvo taikoma kompleksams, kurie buvo surinkti serumo turinčioje CHO terpėje. Šiuo atveju su ląstelėmis susijusios fluorescencijos lygis buvo panašus į tą, kuris buvo pastebėtas kompleksams, paruoštiems be serumo, tačiau įdomu, kad branduolyje fluorescencija nebuvo matoma. Atvirkščiai, buvo tik taškinė fluorescencija, pasiskirsčiusi visoje citoplazmoje, o tai rodo, kad inkubavimo metu nebuvo pūslelių sankaupų ir augimo, atitinkančių kompleksų, surinktų terpėje be serumo, inkubavimą, bet inkubuotą kartu su ląstelėmis, esant serumui.Tipiškas citoplazminis pasiskirstymas ir perinuklearinė lokalizacija kartu su nukleotidų ir lipidų kolokalizacija, atspindima geltonos spalvos, greičiausiai reiškia komplekso įstrigimą endosominiame ir#x02013lysosominiame kelyje (​ pav. (5C pav. 5 C ir D ), o tai reiškia, kad ODN neatsiskyrė nuo komplekso. Atitinkamai, kai inkubacija su 80 nm dalelėmis, gauta ruošiant kompleksą NaCl –HEPES, užtikrina veiksmingą pristatymą, duomenys rodo, kad disociacija, o ne dalelių dydis reiškia greitį ribojantį ODN pristatymo žingsnį.

Po disociacijos ir atvykimo į branduolį galiausiai ištyrėme, ar taip pristatytas ODN pasirodė esąs veiksmingas perduodant biologinį atsaką.

SAINT-2 sukeltas antisense S-ODN pristatymas efektyviai sumažina CRF-R mRNR ir baltymų kiekį

Norint nustatyti SAINT-2 𠄽OPE pajėgumą tiekti ODN farmakologiškai aktyviais kiekiais, antisensinių ODN, nukreiptų į žiurkių CRF-R, gebėjimas sumažinti mRNR lygį buvo ištirtas atlikus noterno bloto analizę. CHO ląstelės buvo inkubuojamos 3 valandas su kompleksu, susidedančiu iš 100 nM antisense S-ODN ir 20 µM SAINT-2 𠄽OPE, nesant serumo, po to pridedant 10 % terpės turinčios terpės. Po 24 valandų inkubacijos ląstelės buvo surinktos, o visa RNR ekstrahuota ir perkelta į nailono membranas. Blotai pirmiausia buvo tiriami 32 P pažymėtais CRF-R zondais, o po to pašalinami ir pakartojami 32 P pažymėtais GAPDH zondais. GAPDH buvo naudojamas kaip vidinė RNR įkėlimo kontrolė. Santykiniai mRNR kiekiai buvo nustatyti densitometriniu autoradiografų matavimu, nuskaitydami apibrėžtą tašką apimančią sritį, kuri buvo vienoda visoms dėmėms, o CRF-R mRNR kiekis buvo normalizuotas iki GAPDH mRNR. Panaudojus antisense S-ODN, CRF-R mRNR sumažėjo � ir#x00025. Bet kuri antisense seka (1 ir 2, žr. Medžiagos ir metodai) parodė maždaug tokį patį efektyvumą. Jokio poveikio nepastebėta, kai ląstelės buvo apdorotos tik antisense S-ODN arba kompleksu, susidedančiu iš nesuderinamų ODN ir SAINT-2 𠄽OPE, pabrėžiant pastebėto efekto specifiškumą. Pastaroji kontrolė taip pat rodo, kad katijoninis lipidų mišinys nedaro reikšmingos įtakos CRF-R ekspresijai nespecifiniu būdu, pavyzdžiui, paveikdamas ląstelių citotoksiškumą. Tai visiškai atitinka duomenis, pateiktus 2 paveiksle ir 2 paveiksle, kuriuose toksinis poveikis buvo tiesiogiai stebimas. Atrodo, kad šiek tiek sumažėjęs aktyvumas 9 juostoje (​ (6 pav.), 6 pav.), Kuriame buvo pridėta laisvų pūslelių, o ne kompleksų, galėjo atsirasti dėl GAPDH ekspresijos svyravimų, o ne dėl toksinis amfifilio poveikis. Bet kokiu atveju duomenys kartu su 2 paveiksle pavaizduotais 2 patvirtina nuomonę, kad ODN ir#x02013 lipidų kompleksai yra mažai toksiški ląstelėms. Taigi SAINT-2 𠄽OPE sugebėjo efektyviai pristatyti antisense ODN į CRF-R ekspresuojančias CHO ląsteles ir dėl to sukelti stiprų ir selektyvų genų ekspresijos slopinimą.

Specifinis CRF-R pasiuntinio RNR reguliavimas antisense S-ODN. CRF-R ekspresuojančios CHO ląstelės buvo apdorotos lipopleksais, paruoštais iš 100 nM S-ODN ir 20 µM SAINT-2 𠄽OPE 3 valandas (nesant serumo), o vėliau 24 valandas inkubuojami 10 ir#x00025 serumuose -turinti terpę. Tada visa RNR buvo izoliuota, frakcionuota ant agarozės formaldehido gelių ir nuvaloma ant nailono membranos, kaip aprašyta medžiagose ir metoduose. Ši membrana buvo zonduota 32 P-radioaktyviai pažymėta CRF cDNR (CRF-R), tada pašalinta ir pakartotinai padaryta 32 P-radioaktyviai pažymėta GAPDH cDNR (GAPDH). GAPDH naudojamas kaip vidinė RNR įkėlimo kontrolė. Atkreipkite dėmesį, kad CRF-R mRNR sumažėjimas buvo pastebėtas tik tada, kai SAINT-2 ir#x02013DOPE (SD) pristatė antisense ODN. Kiekvienas iš pirmiau minėtų eksperimentų buvo pakartotas dviem egzemplioriais ir buvo gauti panašūs rezultatai. Buvo naudojamos dvi antisense sekos, antisense 1 ir antisense 2 (sekų ieškokite medžiagose ir metoduose). MAS1 (2) ir#x0002b SD rodo rezultatus, gautus naudojant lipoplekses, kuriose yra nesuderinamos antisense (AS) 1 arba 2. Kaip neigiama kontrolė, CHO ląstelės be CRF-R ekspresijos buvo apdorotos ir analizuojamos panašiai (CHO ląstelės, be CRF-R)

Norėdami patikrinti mRNR sumažėjimo pasekmes receptorių ekspresijos sumažėjimo požiūriu per se, vėliau mes nustatėme CRF-R ekspresijos lygį Western immunoblot po gydymo antisense ODN. Ląstelės buvo inkubuojamos su kompleksais, kaip aprašyta aukščiau, ty 100 nM ODN ir 20 µM SAINT-2 𠄽OPE be serumo 3 val., Po to buvo pridėta serumo turinti terpė, o ląstelės paliktos 24 val. . Tada ODN kompleksai buvo pašalinti plaunant ląsteles ir pridėta šviežios terpės. Po dar 48 valandų ląstelių membranos buvo izoliuotos, o CRF-R buvimas buvo nustatytas, kaip aprašyta medžiagose ir metoduose. Kaip parodyta 7 paveiksle ir 7 paveiksle, ryškus CRF-R sumažėjimas buvo pastebėtas tik tada, kai ląstelės buvo apdorotos antisense 1 arba antisense 2 ODN, sujungtos su SAINT-2 ir#x02013DOPE. Atitinkamai, duomenys rodo, kad SAINT-2 ir#D0E-CRF-R antisense pristatymas veiksmingai sumažino tiek mRNR, tiek baltymų kiekį.

Antisense S-ODN poveikis CRF-R ekspresijai. CRF-R buvo analizuojamas naudojant Vakarų imunoblotą. CHO ląstelės, ekspresuojančios CRF-R, kontroliuojamos CMV promotoriaus, buvo apdorotos 100 nM S-ODN ir 20 µM SAINT-2 𠄽OPE 3 valandas be serumo, po to 24 val. Inkubuota 10 ir#x00025 terpė, kurioje yra serumo. Lipopleksai buvo pašalinti plaunant ir pridedama šviežios terpės su serumu. Po dar 48 valandų ląstelių membranos buvo izoliuotos, baltymai buvo atskirti PAGE, zonduoti ožkų anti-žiurkių CRF-R ir tada šarminės fosfatazės konjuguoto triušio anti-ožkos antikūnu. CRF-R sumažėjimas buvo pastebėtas tik tada, kai SAINT-2 𠄽OPE pristatė antisense ODN (antisense 1 ir 2). MAS reiškia gydymą nesuderinamais antisense 1 ir 2. Kiekvienas iš pirmiau minėtų eksperimentų buvo pakartotas dviem egzemplioriais ir buvo gauti panašūs rezultatai.


Katijoninis lipidų transfekcijos optimizavimas 150 mm indams - biologija

Tai yra programos „Ser“ skyrius. 08/220 376, paduotas 1994 m. Kovo 29 d., Dabar JAV patentas Nr. Nr. 5 651 981.

1. Liposomų ir vaistų agregatas, apimantis vieną ar daugiau nukleorūgščių ir vieną ar daugiau liposomų, kiekviena liposoma apima vieną ar daugiau katijoninių fosfolipidų, kurių struktūra: ## STR10 ## kur R1 yra H arba C.1 iki maždaug C.24 tiesios arba šakotos alkilo, alkenilo arba alkinilo grandinės, pasirinktinai pakeistos karbocikliniu, aromatiniu arba heterocikliniu fragmentu,

R2 yra H arba C10 iki maždaug C.24 tiesios arba šakotos alkilo, alkenilo arba alkinilo grandinės, pasirinktinai pakeistos karbocikliniu, aromatiniu arba heterocikliniu fragmentu,

R3 yra vandenilis arba metilas,

R4 yra nuo q iki maždaug C24 tiesios arba šakotosios alkilo, alkenilo arba alkinilo grandinės, pasirinktinai pakeistos karbocikline, aromatine arba heterocikline dalimi, arba R4 yra C1 iki maždaug C.6 tiesios arba šakotos grandinės esteris, aldehidas, ketonas, eteris, halogenalkilas, azidoalkilas arba tetraalkilamonis,

su sąlyga, kad R1 ir R2 nėra abu H ir kad kai R1 yra H, s yra 0, ir kai R2 yra H, t yra 0, ir dar su sąlyga, kad R4 nėra alkenilas arba alkinilas, pakeistas fenilo.

2. Liposomų ir vaistų agregatas, apimantis vieną ar daugiau nukleorūgščių ir vieną ar daugiau liposomų, kiekviena liposoma apima vieną ar daugiau katijoninių fosfolipidų, kurių struktūra: ## STR11 ## R1 ir R2 nepriklausomai yra H arba C1 iki maždaug C.24 tiesios arba šakotos alkilo, alkenilo arba alkinilo grandinės, pasirinktinai pakeistos karbociklinėmis aromatinėmis medžiagomis arba heterociklinėmis dalimis,

R3 yra vandenilis arba metilas,

R4 yra C1 iki maždaug C.24 tiesios arba šakotosios alkilo, alkenilo arba alkinilo grandinės, pasirinktinai pakeistos karbocikliniu aromatiniu arba heterocikliniu fragmentu, arba R4 yra C1 iki maždaug C.6 tiesios arba šakotos grandinės esteris, aldehidas, ketonas, eteris, halogenalkilas, azidoalkilas arba tetraalkilamonis,

R5 yra H arba C1 iki maždaug C.24 tiesios arba šakotos alkilo, alkenilo arba alkinilo grandinės, pasirinktinai pakeistos karbocikliniu aromatiniu arba heterocikliniu fragmentu.

3. Liposomų ir vaistų agregatas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad heterociklinė dalis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš dansilo, nitrobenzofurazano ir 1,6 difenil-1,3,5-heksatrieno.

4. Liposomų ir vaistų agregatas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad heterociklinė dalis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš dansilo, nitrobenzofurazano ir 1,6 difenil-1,3,5-heksatrieno.

5. Su patogenu susijusios ligos gydymo būdas, besiskiriantis tuo, kad įvedamas terapiškai efektyvus liposomų ir vaistų agregato kiekis pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad vaistas slopina esminę patogeno matabolinę ar reprodukcinę funkciją.

6. Su patogenu susijusios ligos gydymo būdas, apimantis terapiškai veiksmingo liposomų ir vaistų agregato kiekio pagal 2 punktą įvedimą, kur vaistas slopina esminę patogeno matabolinę ar reprodukcinę funkciją.

Išradimo esmė

Šis išradimas susijęs su naujais katijoniniais fosfolipidais ir jų gamybos metodais. Šis išradimas taip pat susijęs su naujomis liposomomis ir agregatais, apimančiais šio išradimo fosfolipidus, kurie yra naudingi nukleorūgščių ir vaistų tiekimui į ląsteles tiek in vitro, tiek in vivo. Šis išradimas taip pat susijęs su ligų gydymu genų terapija, apimančia transfekciją DNR ir įvedimą į antisense nukleotidų ląsteles, taip pat stabilią transfekciją DNR, sukurtą įtraukti į gyvų ląstelių genomą.

2. Susijusio straipsnio aprašymas

Svetimų nukleorūgščių ir kitų molekulių įvedimas yra vertingas būdas manipuliuoti ląstelėmis ir turi didelį potencialą tiek molekulinėje biologijoje, tiek klinikinėje medicinoje. Endogeninių nukleorūgščių įterpimui į eukariotines ląsteles buvo naudojama daug metodų. Pvz., Graham ir Van der Eb, Virology 52, 456 (1973) (DNR nusodinimas kartu su kalcio fosfatu) Kawai ir Nishizawa, Mol. Ląstelė. Biol. 4, 1172 (1984) (polikationas ir DMSO) Neumann ir kt., EMBO leidinys 1, 841 (1982) (elektroporacija) Graessmann ir Graessmann in Microinjection and Organelle Transplantation Techniques, p. 3-13 (Cells et al., Eds. , Academic Press 1986) (mikroinjekcija) Cudd ir Nicolau in Liposome Technology, p. 207-221 (G. Gregoriadis, Red., CRC Press 1984) (liposomos) Cepko ir kt., Cell 37, 1053 (1984) (retrovirusai) ir Schaffner, Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 77, 2163 (1980) (protoplastų sintezė). Įrodyta ir laikina, ir stabili genų transfekcija.

Kai kurie pirmieji darbai dėl endosogeninių medžiagų liposomų pristatymo į ląsteles įvyko prieš maždaug dvidešimt metų. Į ląsteles buvo įvestos svetimos nukleorūgštys (Magee ir kt., Biochim. Biophys. Acta 451, 610-618 (1976), Straub ir kt., Infect. Immun. 10, 783-792 (1974)), kaip ir svetimi lipidai (Martin ir MacDonald, J. Cell Biol. 70, 515-526 (1976)), baltymai (Magee ir kt., J. Cell. Biol. 63, 492 (1974)), Steger ir Desnick, Biochim. Biophys. Acta 464 530 (1977)), fluorescenciniai dažai (Leventis ir Silvius) ir vaistai (Juliano ir Stamp, Biochem. Pharm. 27, 21-27 (1978), Mayhew ir kt., Cancer Res. 36, 4406 (1976), Kimelberg, Biochim. Biophys. Acta 448, 531 (1976)), visi naudoja teigiamai įkrautus lipidus.

Iš daugelio metodų, naudojamų palengvinti DNR patekimą į eukariotines ląsteles, katijoninės liposomos yra vienos iš efektyviausių ir buvo plačiai naudojamos kaip DNR nešėjai transfekcijos eksperimentuose. Apskritai žr. Thierry ir kt. genų reguliavimas: Antisense RNR ir DNR biologija, p. 147 (Ericksonas ir Izantas, red., Raven Press, Niujorkas, 1992) Hug and Sleight, Biochim. Biofizai. Acta 1097, 1 (1991) ir Nicolau ir Cudd, Crit. Kun. Narkotikas Carr. Sys. 6, 239 (1989). Transfekcijos procesas naudojant liposomas vadinamas lipofekcija. Vyresnysis ir kt., Biochim. Biofizai. Acta 1070, 173 (1991) pasiūlė, kad katijoninių lipidų įtraukimas į liposomas yra naudingas, nes padidina neigiamai įkrautų molekulių, kurios gali būti susietos su liposoma, kiekį. Tirdami teigiamai įkrautų liposomų ir kraujo sąveiką, jie padarė išvadą, kad apribojus dozę žmonėms galima išvengti žalingo šalutinio poveikio, susijusio su makroskopine liposomų ir plazmos agregacija.

Felgner ir kt., Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 84, 7413 (1987), parodė, kad dioleoilfosfatidil-etanolamino (DOPE) ir sintetinio katijoninio lipido N-1- (2,3-dioleloksi) propil! -N, N, N-trimetilamonio chloridas (DOTMA) liposomos gali abu laikinai ir stabiliai transfekuoja DNR. Rose ir kt., BioTechiques 10, 520 (1991), išbandė lipofekciją su liposomomis, susidedančiomis iš DOPE ir vieno iš katijoninių lipidų cetildimetiletilamino bromido (CDAB), cetiltrimetiletilamonio bromido (CTAB), dimetildioktadecilamonio bromido (Dimetonchlorido), stearilaminas. Visos liposomos (išskyrus CTAB) sėkmingai perkėlė DNR į HeLa ląsteles. Tačiau esant didelėms koncentracijoms, CDAB ir MBC sukėlė ląstelių lizę. Nustatyta, kad tik DDAB yra veiksmingas tarpininkaujant efektyviai DNR transfekcijai į įvairias kitas ląstelių linijas. Malone ir kt., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 86, 6077 (1989), sėkmingai transfekavo RNR in vitro į įvairias ląstelių linijas. Zhou ir Haung, J. Controlled Release 19, 269 (1992), atskleidė sėkmingą DOPE liposomų lipofekciją, stabilizuotą plokštelės fazėje katijoniniais ketvirtiniais amonio plovikliais. Tačiau autoriai pažymėjo, kad santykinai didelis šių junginių citotoksiškumas apribotų jų naudojimą in vivo.

Hawley-Nelson ir kt., Focus 15, 73 (1990, BRL publikacijos), atskleidė katijoninį lipidą "LIPOFECTAMINE", reagento, kuriame yra 2,3-dioleloksi-N-2 (sperminkarboksiamido) etilo! -N, N-dimetil- 1-propanamini um trifluorocetatas (DOSPA). Nustatyta, kad „LIPOFECTAMINE“ turi didesnį transfekcijos aktyvumą nei keli monokationiniai lipidų junginiai („LIPOFECTIN“, „LIPOFECTACE“ ir DOTAP) šešiuose iš aštuonių ląstelių tipų. Jie pastebėjo toksiškumą, kai lipidai ir DNR buvo įtraukti į tą patį mišinį.

Abu Farhood ir kt., Biochim. Biofizai. Acta 1111, 239 (1992) ir Gao ir Huang, Biochem. Biofizai. Res. Comm. 179, 280 (1991), atskleidžia katijoninius cholesterolio darinius kaip liposomų komponentus, galinčius transfekuoti ląsteles in vitro.

Liposomos, apimančios katijoninius lipidus, taip pat gali būti naudojamos kaip nešikliai genų terapijai in vivo. Kai kurios pirmosios in vivo endogeninių medžiagų tiekimo per liposomas programos buvo parodytos prieš dvidešimt metų. Žr., Pvz., Straub ir kt., Supra, ir Magee ir kt., Supra, (nukleorūgštys) ir Mayhew ir kt., Supra (vaistai).

Holt ir kt., Neuron 4, 203 (1990), aprašo DOTMA dioleoksilfosfatidiletanolamino liposomą, kuri sėkmingai transfekavo vektorių, išreiškiantį luciferazės cDNR, į Xenopus embrionines smegenis in vivo.

Malone, Focus 11, 4 (1989, BRL publikacijos), pranešė apie panašų Xenopus nervinio audinio tyrimą, kaip ir Ono ir kt., Neurosci. Lett. 117, 259 (1990), pelės smegenyse.

Brigham ir kt., Am J. Med. Sci. 298, 278 (1989), atskleidė „LIPOFECTIN“ ir chloramfenikolio acetiltransferazės (CAT) plazmidės intraveninę injekciją į pelės plaučius.

Nabel ir kt., Science 249, 1285 (1990), pranešė apie β-galaktozidazės geno ekspresiją specifiniame arterijos segmente in vivo Jukatano kiaulėse, DNR transfekuojant katijoninėmis liposomomis. Lim ir kt., Circulation 83, 2007 (1991), atskleidė reporterių genų (β-galaktozidazės ir luciferazės) genų perkėlimą in vivo į šunų arterijas, naudojant katijonines liposomas.

Hazinskis, Sem. Perinatolis. 16, 200 (1992) atskleidė katijoninį liposomų sukeltą sulietų reporterių genų perkėlimą į epitelio ląsteles ir laikiną baltymų ekspresiją tiesiogiai įpurškiant DNR-liposomų tirpalą į trachėją.

Yosimura ir kt., Nucleic Acids Res. 20, 3233 (1992) parodė sėkmingą cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatoriaus geno (CFTR) in vivo lipofekciją į pelių kvėpavimo takų epitelį, naudojant katijoninę liposomą „LIPOFECTIN“. Hyde ir kt., Nature 362, 250 (1993), taip pat atskleidė CFTR lipofekciją, naudojant „LIPOFECTIN“. Jie parodė sėkmingą geno pristatymą į kvėpavimo takų epitelį ir į alveoles giliai transgeninių pelių plaučiuose.

Buvo pranešta apie kelis katijoninius amfifilus kaip transfekcijos agentus. Ballas ir kt., Biochim. ir Biophys. Acta 939, 8 (1988), pranešė apie sėkmingą tabako mozaikos viruso RNR lipofekciją į tabako ir petunijos protoplastus per liposomas, sudarytas iš fosfatidilcholino (PC), cholesterolio ir ketvirtinio amonio ploviklio hidroizilo formos diizobutilkresoksietoksietildimetilbenzilamonio (DEBDA OH!). Liposomoms, neturinčioms ketvirtinio amonio ploviklio, praktiškai nepavyko transfekuoti RNR. Svarbu tai, kad Ballas ir kt. taip pat pastebėjo, kad RNR ir DNR susiliejo į liposomas, turinčias DEBDA OH -! buvo labai atsparūs pridėtoms RNR ir DNR.

Pinnaduwage ir kt., Biochim. ir Biophys. Acta 985, 33 (1989), atskleidė pSV2 CAT plazmidės DNR lipofekciją į pelės L929 fibroblastus, naudojant ultragarsines liposomas, apimančias DOPE ir ketvirtinį amonio ploviklį (dodecil-, tetradecil- arba cetil-trimetilamonio bromidą). Pinnaduwage ir kt. tačiau atkreipkite dėmesį, kad pagrindinis vienos grandinės amfifilų, pvz., ploviklių, naudojimas vaistų pristatymui yra jų toksiškumas.

Taylor ir kt., Nucleic Acids Res. 20, 4559-4565 (1992) sėkmingai transfekavo ir RNR ribozimus, ir chimerinius RNR-DNR ribozimus su "LIPOFECTIN".

Leventis ir Sivius, Biochim. ir Biophys. Acta 1023, 124 (1990), buvo atskleisti keli katijoniniai amfifilai, kurių pagrindą sudaro hidrofobinė cholesterilo arba dioleoilglicerilo dalis, kurios hidrofobinės ir katijoninės dalys yra sujungtos esteriniais ryšiais, o tai turėtų palengvinti skilimą gyvūnų ląstelėse. Leventis ir Sivius pademonstravo sėkmingą plazmidės pSV2 CAT lipofekciją į CV-1 ir 3T3 ląsteles, naudojant liposomas, kuriose yra katijoninių amfifilų 1,2-dioleoil-3- (4’-trimetilamonio) butanoil-sn-glicerolio (DOTB), DOTAP ir cholesterilo ( 4'-trimetilamonio) butanoatas (ChoTB).

Duzgunes ir Felgner, Methods in Enzymology 221, 303 (1993), aprašo nukleorūgščių transfekcijos metodus. Jie moko, kad ruošiant DNR ir „LIPOFECTIN“ kompleksus transfekcijai, norimas grynasis teigiamas krūvis, o atitinkamas lipidų ir nukleorūgščių masės santykis yra apie 4–10. Tačiau jie įspėja, kad reikia optimizuoti kiekvieną transformuojamą ląstelių liniją.

Tikslus nukleorūgščių ir fosfolipidų (ir kitų amfifilų) sąveikos būdas bei struktūra, susidariusi prieš transfekcijos procesą ir jo metu, nėra gerai suprantamas.Paprastai sakoma, kad nukleorūgštys yra įstrigusios dvigubame lipidų sluoksnyje, kuris yra klasikinis „liposomų“ apibrėžimas. Tačiau taip pat yra įsitikinimas, kad nukleorūgštis neįsiskverbia, o su fosfolipidais sudaro kitokį agregatą. Žr., Pvz., Smith ir kt., Biochim. Biofizai. Acta 1154, 327 (1993), keliems lipidų/nukleorūgščių sąveikos modeliams. Maccarrone ir kt., Biochem. Biofizai. Res. Comm. 186, 1417 (1992), atskleidė, kad liposomų ir DNR agregato dydis ir forma priklauso nuo DNR kiekio ir fosfolipido santykio. Jie padarė išvadą, kad DNR jungiasi prie išorinio liposomų paviršiaus, kuris vėliau susirenka į netaisyklingus sferinius agregatus. Jie taip pat pažymėjo, kad plazmidės ilgis neturėjo įtakos prisijungimui prie liposomų. Gershon ir kt., Biochem. 32, 7143-7151 (1993) ištyrė etidžio bromido fluorescenciją, dalyvaujant DOTMA ir DNR. Jie pastebėjo staigų fluorescencijos sumažėjimą, kai DNR/etidžio bromidas titruojamas DOTMA iki beveik neutralaus elektros. Komplekso elektroninė mikroskopija atskleidė staigų DNR kondensaciją neutralumo vietoje. Iš šių eksperimentų akivaizdu, kad bent jau DOTMA, bet tikriausiai ir daugumos katijoninių lipidų atveju, komplekso struktūra keičiasi esant neutraliam įkrovimui, o kartu DNR tampa labai kompaktiškai suskirstyta į struktūrą, kuri akivaizdžiai visiškai skiriasi nuo vezikulinė liposoma. Legendre ir Szoka, Pharm. Res. 9, 1235 (1992), tyrė in vitro lipofekciją, naudojant DOTMA: DOPE liposomą, ir padarė išvadą, kad liposoma tikriausiai naudoja mažiausiai du būdus DNR įvedimui į ląsteles: susiliejimą su plazmos membrana ir endocitozę.

Reikėtų pripažinti, kad praktiškai visi iki šiol literatūroje aprašyti junginiai kaip „katijoniniai lipidai“ iš tikrųjų yra katijoniniai amfifilai arba katijoniniai plovikliai. Terminas „lipidai“ reiškia natūralų produktą. Daugumos lipidų sudėtyje yra riebalų rūgščių kaip pagrindinis hidrofobinis komponentas, nors kai kurie (pvz., Cholesterolis, sfingolipidai ir poliizoprenoidai) turi kitas hidrofobines struktūras.

Fosfatidiletanolamino (PE) reagentų mišiniai su DOTMA arba diokadekildimetilamonio bromidu (DDMB) yra parduodami (pvz., „Promega“). DOTMA pagrindu pagaminti transfekcijos reagentai yra brangūs dėl sintetinio katijoninių lipidų sudėtingumo, o paprasti plovikliai yra pigūs, tačiau jiems reikia praskiesti katijonines rūšis palyginti brangiu PE. Abu rodo didelį citotoksiškumą (ypač vienos grandinės junginiai). Pagrindinės citotoksiškumo priežastys yra neaiškios, tačiau sunku arba neįmanoma metabolizuoti šių medžiagų, o tai gali tik pabloginti ilgalaikio naudojimo metu. Citotoksiškumas nėra aktuali trumpalaikių transfekcijos procedūrų problema, tačiau ji turi būti išspręsta prieš naudojant liposomų transfekciją terapijoje. Todėl pageidautina pigesnių, saugesnių ir efektyvesnių lipidų, naudojamų lipofekcijos technologijoje.

Kaip toliau aprašyta, šiame išradime pateikiami nauji junginiai, turintys šias savybes. Šią naują junginių klasę sudaro fosfogliceridų dariniai, turintys modifikuotą fosfodiesterinę jungtį, kur nesujungiantis deguonis yra alkilinamas, gaminant fosfatesterį. Taip alkilinant fosfato fragmentą, pašalinamas neigiamas deguonies krūvis.

Buvo pranešta apie fosfodiesterinių jungčių metilinimą, gaunant P (O) -metilo darinius. Renkonenas, Biochimas. ir Biophys. Acta 152, 114 (1968). Nors apdorojus fosfatidilcholiną (PC) diazometanu, gaunama dimetilfosfatidinė rūgštis ir prarandama cholino liekana, 0-metilfosfatidilcholinis iš šios reakcijos buvo išskirtas nedideliu derliumi, kai protonų donoras buvo trietilamonio hidrochloridas. Tačiau diazometanas paruošiamojo masto yra labai pavojingas, o lengvai prieinamų diazoalkanų skaičius yra ribotas. Taip pat pažymime, kad metilfosfatidilcholiniumas yra palyginti nestabilus. Taigi pageidautinas veiksmingesnis fosfatidilcholino fosfatesterio darinių gamybos metodas.

Čia mes atskleidžiame naują katijoninių fosfolipidų klasę, galinčią generuoti liposomas. Šio išradimo fosfolipidai yra gauti iš pirminių fosfogliceridų junginių, turinčių šias struktūras: kur vienas arba abu iš R1 ir R2 paprastai yra angliavandenilių grandinės, turinčios nuo 1 iki maždaug 24 anglies atomų, pasirinktinai pakeistų dansilu, NBD (nitrobenzofurazanas), DPH (1,6-difenil-1,3,5-hexatriene), karbociklo grupė arba heterociklinė dalis, s ir t nepriklausomai yra 0 arba 1, R3 yra vandenilis arba metilas, o n yra 0, 1 , 2 arba 3. Tinkamiausiame šio išradimo įgyvendinimo variante pirminis fosfogliceridų junginys yra natūraliai randamas. Ypač tinkamame įgyvendinimo variante junginys yra fosfatidilcholinas.

Nauji šio išradimo fosfolipidai, gauti alkilinant aukščiau minėtus reagento junginius, turi tokią struktūrą: kur visi aukščiau aprašyti pagrindinio junginio apibrėžimai yra, R4 yra pasirinktinai pakeistas C1 iki maždaug C.24 angliavandenilių grandinė.

Šie lipidai yra patrauklūs dėl kelių priežasčių. Pirma, mes nustatėme, kad liposomos ir agregatai, apimantys šiuos katijoninius fosfolipidus, yra veiksmingi transfekuojant nukleorūgštis, kurių efektyvumas yra panašus į dažniausiai naudojamo komercinio produkto „LIPOFECTIN“ efektyvumą. Antra, dauguma šio išradimo fosfolipidų yra lengvai pagaminami iš pigių ir lengvai prieinamų pradinių medžiagų sintezės metu. Galiausiai, dauguma šio išradimo fosfolipidų yra gauti iš natūraliai atsirandančio pirminio junginio, taip užtikrinant ląstelių metabolizmo priemones ir sumažinant šių junginių citotoksiškumą, kai jie vartojami nuolat.

Mes taip pat atskleidžiame junginius, gautus iš sfingofosfolipidų, fosfolipidų, turinčių polinę fosforilcholino grupę, identišką fosfatidilcholino grupei, tačiau su keramidu vietoj dialkilglicerolio hidrofobinėje molekulės dalyje. Sfingofosfolipidai alkilinami taip pat, kaip ir aukščiau aptarti fosfogliceridai, generuojant atitinkamus cholinio junginius. Bendra sfingofosfolipidų struktūra yra tokia: čia R35 yra riebalų rūgštis arba panaši karboksirūgštis, to paties tipo kaip R1, aukščiau. Alkilinimas yra toje pačioje padėtyje (ant fosfato deguonies), kaip ir fosfogliceriduose.

Taip pat pristatome naują šio išradimo katijoninių fosfolipidų sintezės metodą. Pageidautinas metodas apima pirminio fosfolipido junginio (kurio struktūra yra aukščiau apibrėžta) alkilinimą, liečiant jį su R4 -trifluormetansulfonatu (triflatu) tinkamame tirpiklyje, kur R4 yra apibrėžtas aukščiau. Tinkamiausiame įgyvendinimo variante tirpiklis yra eteris. Šis metodas yra ir pigus, ir lengvas, iš dalies dėl daugelio pagrindinių fosfolipidinių junginių (pvz., Sfingofosfolipidų ir fosfogliceridų) prieinamumo ir mažos kainos, lengvos alkilo triflatų sintezės ir greitos reakcijos, atsirandančios šalia arba netoli jos. kambario temperatūra. Tinkamiausiame šio išradimo įgyvendinimo variante pirminis fosfolipidinis junginys yra fosfatidilcholinas, kurį galima gauti iš kiaušinio trynio, kitų natūralių šaltinių arba sintetinti.

Kartu su bendru pirminio fosfolipido prieinamumu šis sintezės metodas suteikia platų fosfonio darinių spektrą, turintį poliarines galvos grupes ir lipidines šonines grandines, kurios skiriasi savo sterinėmis ir elektroninėmis savybėmis, ypač hidrofobiškumu ir hidrofilumu. Taigi, šio išradimo metodai ir junginiai iš esmės leidžia sureguliuoti fosfolipido savybes beveik į bet kurią norimą būseną.

Šiame išradime taip pat numatyti patobulinti transfekcijos metodai, naudojant šio išradimo fosfolipidus. Naudojant standartinius metodus, nukleorūgštys gali būti labai efektyviai transfekuojamos į ląsteles in vitro arba in vivo. Šis išradimas taip pat siūlo patobulintus vaistų tiekimo būdus.

Šiame išradime taip pat numatyti patobulinti pacientų, sergančių ligomis ar negalavimais, kuriuos galima gydyti nukleorūgštimis, oligonukleotidais ar vaistais, gydymo metodai. Tokios ligos yra ligos, atsirandančios dėl infekcijos patogenu, tokiu atveju gydymas gali apimti antisensinio oligonukleotido, nukreipto į patogeno endogeninę nukleorūgštį, kuri yra būtina patogeno vystymosi, metabolinei ar reprodukcinei funkcijai, įvedimą arba narkotikas. Kitos ligos apima tas, kurios atsiranda dėl DNR trūkumo. Toks trūkumas gali būti esminės DNR trūkumas arba mutacija (pvz., Vieno ar kelių nukleotidų ištrynimas, pakeitimas ar pridėjimas), dėl kurios genas yra nepakankamai ar per daug išreikštas arba nenormalus baltymas. Tokiu atveju gydymas gali apimti normalios nukleorūgšties lipofekciją.

Trumpas brėžinių aprašymas

Fig. 1 pavaizduotas sintetinis fosfogliceridų alkilinimo metodas, gaunantis O-pakeistus darinius.

Fig. 2 yra autoradiograma, rodanti chloramfenikolio acetiltransferazės tyrimo rezultatus, gautus naudojant LV ir Rcho-1 ląstelių ekstraktus, transfekuotus RSV-CAT DNR.

Fig. 3 pateikiami NBD-EtPC + santykinio transfekcijos efektyvumo CAT tyrimo rezultatai.

Išsamus išradimo aprašymas

Šiame išradime pateikiami nauji katijoniniai fosfolipidai, liposomos, apimančios šiuos fosfolipidus, liposomų nukleorūgščių agregatai, nukleorūgščių transfekcijos in vitro ir in vivo metodai, apimantys ląstelės ar ląstelių kontaktą su liposomų-nukleorūgščių agregatais, ir infekcijos sukeltų ligų gydymo metodai. arba DNR trūkumas, gydomas in vivo tiekiant nukleorūgštis.

Pirmuoju šio išradimo aspektu aprašomi nauji katijoniniai fosfolipidai. Šie katijoniniai fosfolipidai gali sudaryti liposomas ir pernešti į ląsteles nukleorūgštis. Patrauklus šios klasės junginių bruožas yra tas, kad juos galima sintetinti iš pigių, lengvai gaunamų pirminių fosfogliceridų junginių. Šie fosfogliceridų junginiai turi tokią struktūrą: kur R1 ir R2 nepriklausomai yra H arba C1 iki maždaug C.24 tiesios arba šakotos alkilo, alkenilo arba alkinilo grandinės, pasirinktinai pakeistos dansilo, NBD, DPH, karbociklinių aromatinių ar heterociklinių liekanų,

R3 yra vandenilis arba metilas,

su sąlyga, kad R1 ir R2 abu nėra H ir kad kai R1 yra H, s yra 0, o kai R2 yra H, t yra 0.

Tinkamiausiame šio išradimo įgyvendinimo variante pirminis fosfogliceridų junginys yra natūraliai arba lengvai gaunamas iš natūraliai esančio junginio. Ypač tinkamame įgyvendinimo variante pirminis fosfogliceridų junginys yra fosfatidilcholinas. Fosfatidilcholinas yra labai pigus ir lengvai gaunamas iš kiaušinio trynio.

Nauji šio išradimo fosfolipidai, gauti iš aukščiau išvardytų reagento junginių, turi tokią struktūrą: kur visi aukščiau aprašyti pagrindinio junginio apibrėžimai yra, R4 yra C1 iki maždaug C.24 tiesios arba šakotos alkilo, alkenilo arba alkinilo grandinės, pasirinktinai pakeistos dansilu, NBD, DPH, karbocikline aromatine arba heterocikline dalimi, arba R4 yra C1 iki maždaug C.6 tiesios arba šakotos grandinės esteris, aldehidas, ketonas, eteris, halogenalkilas, azidoalkilas arba tetraalkilamonis.

Čia vartojamas terminas "alkenilas" reiškia fragmentą, turintį nuo 1 iki 6 dvigubų ryšių. "Alkinilas" reiškia fragmentą, turintį 1 arba 2 trigubus ryšius. „Šakota grandinė“ turi nuo 1 iki 4 išsišakojančių metilų ir iki 2 ciklopropilo grupių. „Karbocikliniai aromatiniai“ turi iki 4 žiedų, kurie gali būti sulieti arba spiro, ir 5 arba 6 anglies atomus kiekviename žiede. „Heterociklinė dalis“ reiškia 1–3 žiedus, turinčius 5 arba 6 atomus žiede arba žieduose ir iki 2 deguonies arba azoto viename žiede.

Tinkamiausiame įgyvendinimo variante junginys yra natūraliai atsirandančio junginio fosfotesterio darinys. Ypač tinkamame įgyvendinimo variante junginys yra fosfatidilcholino fosfotesterio darinys. Kitame tinkamiausiame įgyvendinimo variante junginys yra fosfatidilcholino etilo fosfotesterio darinys. Dar kitame tinkamame įgyvendinimo variante R1 arba R2 yra NBD pakeistas C6 -C12 alkilas. Kaip išsamiau aprašyta toliau, mes paruošėme keletą šių junginių.

Antroji naujų katijoninių fosfolipidų grupė yra gauta iš sfingofosfolipidais susijusių junginių, turinčių bendrą struktūrą, klasės: kur R5 yra riebalų rūgštis arba susijusi karboksirūgštis, turinti tokią pačią struktūrą kaip R1, aukščiau. Sfingofosfolipidai alkilinami taip pat, kaip ir fosfogliceridų junginiai. Alkilo grupė prideda tą pačią fosfato deguonies padėtį kaip ir fosfogliceridai, kad gautų: ## STR7 ##

Kaip bus išsamiau aprašyta toliau, buvo nustatyta, kad šie šio išradimo katijoniniai fosfolipidai yra veiksmingi nukleorūgščių ir vaistų transfekcijos agentai.

Antrame šio išradimo aspekte yra aprašytas naujas minėtų fosfolipidų sintezės metodas. Šio išradimo sintetinis metodas apima R4 pakeisto trifluormetansulfonato (triflato) sumaišymą su pirminiu fosfogliceridu arba sfingofosfolipidu tinkamame tirpiklyje, kur R4 yra C1 iki maždaug C.24 tiesios arba šakotos alkilo, alkenilo arba alkinilo grandinės, pasirinktinai pakeistos dansilo, NBD, DPH, karbociklinių aromatinių ar heterociklinių liekanų, arba R4 yra C1 iki maždaug C.6 tiesios arba šakotos grandinės esteris, aldehidas, ketonas, eteris, halogenalkilas, azidoalkilas arba tetraalkilamonis. Tinkamu tirpikliu reiškiamas bet koks tirpiklis, galintis ištirpinti abi reagento rūšis ir kuris pats savaime nevyksta cheminė reakcija su pradinėmis medžiagomis, tarpiniais produktais ar produktais. Tinkamus tirpiklius šios srities specialistai atpažins arba galės nustatyti įprastu būdu. Tinkamiausiame įgyvendinimo variante tirpiklis yra dietilo eteris. Reakcija greitai vyksta kambario temperatūroje, kad beveik akimirksniu gautų aukščiau aprašytus fosfolipidus. Tada produktus galima išvalyti bet kokiomis tinkamomis priemonėmis. Pageidautinas valymo būdas yra paprasta chromatografija SiO2.

Esant neutralioms sąlygoms, reakcija vyksta perkeliant triflato pakaitą į nesujungiantį fosfato deguonį, kad susidarytų fosfotriesteris. Esant steriškai sutrikusiai bazei (pvz., Kolidinui) ir kai R3 yra vandenilis, bus pakeistas ir fosfatinis deguonis, ir azoto etanolaminas. Žr. 1.

Tinkamiausias šio išradimo metodas apima eterinio fosfogliceridų pirminio junginio tirpalo reakciją su alkil-trifluormetansulfonatu. Rezultatas yra beveik akimirksniu švarus pavertimas pakeistu fosfotriesterio dariniu iš pirminio fosfogliceridų junginio kaip triflato druska. Tada gryninimas atliekamas naudojant paprastą SiO chromatografiją2, kuris suteikia gryno alkilfosfolipidinio tristerio, kurio izoliacija 85% 1 gramo skalėje. Tinkamiausiame įgyvendinimo variante alkilo grupė yra etilo liekana.

Pakeisti triflatai lengvai gaminami pagal šią reakciją. ## STR8 ## Triflic anhidridą galima įsigyti, pavyzdžiui, iš „Alrich®“.

Naudodami šio išradimo metodus, atlikome šias sintezes: ## STR9 ##

______________________________________
Cmpd Cmpd Produktas # reaktantas # (R 4)
______________________________________

1 R 1 = R 2 = C17 H33
2 CH3
3 CH2 CH3
10 (CH2)6 Br
11 (CH2)6 N3
4 R 1 = R 2 = C11 H23
7 CH2 CH3
5 R.1 = C.17 H33
8 CH2 CH3
R2 = CH3
9 CH2 CH3
______________________________________

kur t = s = 1, n = 3 ir R3 = CH3. 10 ir 11 junginiai buvo paruošti -78 ° C temperatūroje. Funkcinės grupės junginiuose 10 ir 11 gali būti modifikuotos, kad būtų galima konjuguoti katijoninį lipidą su kitomis molekulėmis.

Tiek natūraliai esančių, tiek sintetinių fosfolipidų prieinamumas kartu su plačiu alkil triflatų prieinamumu suteikia vieningą kelią į įvairiausių katijoninių lipidų sintezę. Tai turėtų suteikti galimybę sureguliuoti transfekcijos reagento molekulines ir biologines savybes ir suteikti galimybę ištirti lipidų pagrindu pagamintos transfekcijos molekulinį pagrindą. Galiausiai, katijoninio lipido pagrindas natūraliame fosfolipidų karkase numato ilgalaikio citotoksiškumo susilpninimą metaboliniu būdu junginį paverčiant natūraliu produktu.

Nors tinkamiausias šio išradimo junginių gamybos būdas yra aprašytas naujas triflato metodas, šios srities specialistai pripažįsta, kad gali būti naudojami kiti žinomi sintezės metodai. Pavyzdžiui, kitos alkilinančios medžiagos, kurios gali būti naudojamos, yra alkiljodidai, alkilo tozilatai, dialkilsulfatai ir trialkilo oksonis, kur anijonas yra BF4 - .

Dėl savo unikalių sterinių ir elektroninių savybių modifikuoti katijoniniai fosfolipidai, susintetinti minėtais metodais, sukuria naują liposomų klasę, kuri yra labai efektyvi nukleorūgščių lipofekcijai. Čia vartojamas terminas „liposoma“ apima visas fosfolipidų (ir (arba) kitų amfifilų) kompozicijas, susikaupusias vandeniniame tirpale, įskaitant miceles, taip pat kubines ir šešiakampes fazes.

Šio išradimo liposomos apima vieną ar daugiau šio išradimo fosfolipidų. Pagal išradimą liposomos pasirinktinai turi vieną ar daugiau kitų amfifilų. Tiksli liposomų sudėtis priklausys nuo konkrečių aplinkybių, kurioms jie turi būti naudojami. Įprasti šios srities specialistai nustatys, kad tinkama kompozicija yra įprastas dalykas. Šio išradimo liposomos apima bent vieną šio išradimo fosfolipidą. Tinkamiausiame įgyvendinimo variante šio išradimo liposomas iš esmės sudaro vieno tipo išradimo fosfolipidas. Kitame tinkamame įgyvendinimo variante liposomos apima junginių pagal šį išradimą mišinius. Dar kitame tinkamame įgyvendinimo variante šio išradimo liposomos apima vieną ar daugiau šio išradimo fosfolipidų mišinyje su vienu ar daugiau natūralių arba sintetinių lipidų, pvz., Cholesterolio. Dar kitame tinkamame įgyvendinimo variante liposomas iš esmės sudaro fosfatidilcholino etilo fosfotesterio darinys. Įprastas dalykas, naudojant gerai žinomus metodus, nustatyti tinkamą ir optimalų komponentų santykį, kai naudojami fosfolipidų mišiniai.

Liposomos yra pagamintos gerai žinomais metodais. Pvz., Liposomų technologija, t. 1-3 (G. Gregoriadis, Red., CRC Press, 1993) Lipidai paprastai ištirpinami chloroforme ir plonu sluoksniu paskleidžiami ant mėgintuvėlio ar kolbos paviršiaus rotaciniu garinimu. Jei pageidaujama liposomų, sudarytų iš lipidų mišinio, atskiri komponentai sumaišomi pradiniame chloroformo tirpale. Pašalinus organinį tirpiklį, pridedama fazė, susidedanti iš vandens, pasirinktinai turinčio buferio ir (arba) elektrolito, ir indas maišomas, kad būtų suspenduota lipidinė medžiaga.Tada suspensija ultragarsu arba ultragarsinėje vonioje, arba naudojant zondo ultragarsą, tol, kol sumažės dalelių dydis ir suspensija bus norimo skaidrumo. Transfekcijai vandeninė fazė paprastai yra distiliuotas vanduo, o suspensija apdorojama ultragarsu, kol bus beveik skaidri, o tai užtrunka keletą minučių, priklausomai nuo sąlygų, tipo ir ultragarso aparato kokybės. Paprastai lipidų koncentracija yra 1 mg/ml vandeninės fazės, tačiau lengvai gali būti dešimt kartų didesnė ar mažesnė.

Trečiuoju išradimo aspektu pateikiamas naujas lipofekcijos metodas, apimantis transformuojamų ląstelių kontaktą su liposomų-nukleorūgščių agregatų tirpalu. Liposomų-nukleorūgščių agregatai gali būti paruošti įpilant reikiamą kiekį nukleorūgšties į liposomų tirpalą. Transfekcijai katijoninių lipidų ir DNR santykis yra nuo šiek tiek daugiau nei 1: 1 iki galbūt 10: 1. DNR kiekis gali labai skirtis, bet paprastai yra nuo kelių iki kelių dešimčių mikrogramų viename standartiniame ląstelių kultūros inde. Sąlygos gali labai skirtis, ir tai yra įprastas dalykas ir įprasta praktika optimizuoti kiekvieno tipo elementus, kaip rekomenduoja komercinių medžiagų tiekėjai. Optimizavimas apima lipidų ir DNR santykio bei bendro užpildo kiekio keitimą.

Kaip buvo pastebėta, šiuo metu yra tam tikras neaiškumas dėl tikslaus nukleorūgščių ir fosfolipidų (ir kitų amfifilų) sąveikos būdo. Be to, dar nėra galutinai žinoma struktūra, susidariusi prieš transfekcijos procesą ir jo metu. Tačiau šis išradimas neapsiriboja konkrečiu struktūriniu komplekso tipu, kurį sudaro šio išradimo liposomos ir transfekuojamos nukleorūgštys. Taigi čia vartojama frazė „liposomų-nukleorūgščių agregatas“ reiškia bet kokią liposomų ir nukleorūgščių jungtį, galinčią lipofekcionuoti.

Lipidų-nukleorūgščių agregatas pridedamas prie ląstelių auginimo terpėje ir paliekamas nuo kelių dešimčių minučių iki kelių valandų, o gal ir per naktį. Paprastai šiame transfekcijos etape serumas pašalinamas iš auginimo terpės. Vėliau terpė pakeičiama įprasta, serumo turinčia terpe, o ląstelės inkubuojamos nuo valandų iki dienų arba galbūt auginamos neribotą laiką.

Tiek P (O) metilintas fosfatidilcholinas (MePC +, 2), tiek etilintas fosfatidilcholinas (EtPC +, 3) yra veiksmingi DNR transfekcijos į eukariotines ląsteles tarpininkai, parodantys RSV-CAT transfekcijų efektyvumą (pvz., Gorman ir kt., Mol. Cell) . Biol. 2, 1044 (1982) de Wet ir kt., Mol. Cell. Biol. 7, 725 (1987)) į L ląsteles ir Rcho-1 ląsteles, lygiavertes ar geresnes už pastebėtas naudojant "LIPOFECTIN" (3 pavyzdys) ir 2 pav.). Skirtingai nuo esamų transfekcijos reagentų, pagamintų iš katijoninių ploviklių, MePC + (2) ir EtPC + (3) yra veiksmingi transfekcijos reagentai, nesant fosfatidietanolamino (PE). Šio skirtumo priežastys šiuo metu nėra aiškios, tačiau naujausi tyrimai parodė, kad PE ko-lipidų poreikis „LIPOFECTIN“ skiriasi priklausomai nuo ląstelių tipo ir kultūros amžiaus. Jarnagin ir kt., Nucl. Acids Res. 20, 4205 (1992). Įdomu tai, kad fluorescencinis nitrobenzofurazanas (NBD) pažymėjo lipidų 9 sukeltą transfekciją geriau nei EtPC + (3), nes ląstelės, transfekuotos naudojant EtPC + (3) ir 9 mišinius, parodė didėjantį CAT aktyvumą, nes padidėjo 9 dalis mišinyje. Tai rodo, kad riebalų rūgščių pakaito pobūdis fosfogliceridų pagrindiniame junginyje vaidina svarbų vaidmenį nustatant DNR transfekcijos efektyvumą. Galimybė paruošti įvairų katijoninių fosfatidilcholino darinių rinkinį, naudojant šio išradimo metodus, leis sistemingiau ištirti struktūrinius veiksnius, susijusius su DNR transfekcija katijoninėmis liposomomis, ir suteiks daugiau įvairių katijoninių liposomų, naudingų lipofekcijai.

Daugybė nukleorūgščių gali būti susietos su šio išradimo liposomomis ir transfekuotos. Tai apima DNR, RNR, DNR/RNR hibridus (kiekvienas iš jų gali būti viengubas arba dvigubas), įskaitant oligonukleotidus, tokius kaip antisense oligonukleotidai, chimeriniai DNR-RNR polimerai ir ribozimai, taip pat modifikuotas šių nukleorūgščių versijas. gali būti bazėje, cukraus dalyje, fosfato jungtyje arba bet kuriame jų derinyje.

Iš to, kas išdėstyta pirmiau, šios srities specialistams bus aišku, kad šio išradimo liposomos yra naudingos tiek in vitro, tiek in vivo. Šio išradimo liposomos bus pritaikytos beveik bet kokiam in vitro naudojimui, kai reikia nukleorūgščių transfekcijos į ląsteles-vienas iš tokių pavyzdžių yra rekombinantinio baltymo gamybos procesas.

Nukleorūgštis gali sudaryti esminis genas arba jo fragmentas, kurio tikslinei ląstelei ar ląstelėms tam tikru būdu trūksta, pavyzdžiui, trūksta geno arba kai genas yra mutavęs, dėl to nepakankamai arba per daug išreikšta. Susijusios nukleorūgštys taip pat gali apimti antisense oligonukleotidus. Tokie antisense oligonukleotidai gali būti sukonstruoti taip, kad slopintų tikslinio geno ekspresiją. Pirmiau minėti pavyzdžiai yra tik nukleorūgščių, kurios gali būti naudojamos su šiuo išradimu, pavyzdžiai ir nėra skirtos ir neturėtų būti aiškinamos kaip ribojančios išradimą. Šios srities specialistai supras, kad kitos nukleorūgštys bus tinkamos naudoti ir šiame išradime.

Šio išradimo liposomos taip pat yra naudingos vaistų tiekimui. Čia vartojamas terminas "liposomų ir vaistų agregatas" reiškia bet kokią liposomų ir vaistų, galinčių pristatyti vaistą į ląsteles, asociaciją. Čia vartojamas terminas „vaistas“ reiškia bet kokį ne nukleino rūgšties junginį, kuris yra arba gali būti naudojamas kaip terapinis, nesvarbu, ar tai būtų baltymas, ar ne baltymas. Vaistų pristatymo efektyvumas labai pagerėja, jei vaistas yra hidrofobinis. Katijoninių vaistų įsisavinimas gali padidėti, jei į juos įeina priešjonis, pvz., Riebalų rūgštis, arba jei liposomos yra sudarytos iš didelio joninio stiprumo vandeninio tirpalo. Konkretus liposomų ir kapsuliavimo procesas priklausys nuo vaisto. Tačiau įprastas dalykas yra nustatyti tinkamas vaistų pristatymo sąlygas naudojant liposomas.

Fosfolipidų padedamas vaistas gali būti pristatytas tokiu būdu. Vaistams, kurie tirpsta organiniuose tirpikliuose, pvz., Chloroforme, vaistas ir katijoniniai lipidai sumaišomi tirpikliuose, kuriuose abu yra tirpūs, o po to tirpiklis pašalinamas vakuume. Tada vaisto lipidų liekana disperguojama tinkamame vandeniniame tirpiklyje, kuris, pageidautina, yra sterilus fiziologinis tirpalas. Tada suspensija gali būti pasirinkta iki kelių užšalimo/atšildymo ciklų. Tada jis apdorojamas ultragarsu, kad būtų sumažintas dispersijos šiurkštumas arba sumažintas dalelių dydis iki 20–30 nm skersmens, atsižvelgiant į tai, ar didelės ar mažos dalelės yra efektyviausios norimu atveju. Kai kurioms reikmėms gali būti efektyviausia gaminti ekstruzines liposomas, priverčiant suspensiją per filtrą, kurio poros yra 100 nm ar mažesnės. Kai kuriais atvejais gali būti tinkama į mišinį, naudojamą lipidų ir vaistų agregatui gauti, įtraukti cholesterolio arba natūralių fosfolipidų. Tada liposomų ir vaistų agregatas gali būti tiekiamas bet kokiu tinkamu būdu.

Vaistams, kurie tirpsta vandeniniame tirpale ir netirpsta organiniuose tirpikliuose, lipidų mišinys, naudojamas lipidų dispersijai arba liposomoms, yra padengtas ant kolbos arba mėgintuvėlio vidinio paviršiaus, išgarinus tirpiklį iš mišinio tirpalo. Apskritai, norint, kad šis metodas būtų sėkmingas, lipidų mišinys turi sugebėti formuoti pūsleles, turinčias vieną ar kelias lipidines dvisluoksnes sienas ir kapsuliuoti vandeninę šerdį. Vandeninė fazė, kurioje yra ištirpęs vaistas, geriausia fiziologinis fiziologinis tirpalas, pridedama prie lipido, maišoma, kad susidarytų suspensija, tada pasirinktinai užšaldoma ir atšildoma iki kelių kartų. Jei norima sukurti mažas liposomas, suspensija tam tikrą laiką veikiama ultragarso bangų, kad liposomos sumažėtų iki norimo vidutinio dydžio. Jei norima didelių liposomų, suspensija tik maišoma rankomis arba sūkuriniu maišytuvu, kol gaunama vienoda dispersija, t.y., kol nėra vizualiai pastebimų didelių dalelių. Jei preparatas turi būti tik liposomose, tada vaistas vandeninėje fazėje pašalinamas dializės būdu arba praleidžiant per gelio filtravimo chromatografinę kolonėlę (pvz., Agarozę), subalansuotą su vandenine faze, kurioje yra visi normalūs komponentai, išskyrus narkotikas. Vėlgi, panaudotame lipidų mišinyje, be šio išradimo katijoninių junginių, gali būti cholesterolio arba natūralių fosfolipidų. Tada liposomų ir vaistų agregatas gali būti tiekiamas bet kokiu tinkamu būdu.

Ketvirtasis šio išradimo aspektas apima naujus ligų, atsiradusių dėl infekcijos patogenu arba dėl endogeninio DNR trūkumo, gydymo metodus. Šie metodai apima liposomų-nukleorūgščių agregato ir (arba) liposomų-vaistų agregato tirpalo įvedimą žinduoliui, kenčiančiam nuo patogeninės infekcijos ar DNR trūkumo. Jei ligą sukėlė patogenas, nukleorūgštis gali būti, pavyzdžiui, antisense oligonukleotidas, nukreiptas prieš patogeno DNR seką, kuri yra būtina patogeno vystymuisi, metabolizmui ar dauginimuisi. Jei liga yra DNR trūkumas (t. Y. Kai trūksta tam tikros endogeninės DNR arba ji buvo mutavusi), dėl to nepakankamai arba per daug išreikšta, nukleorūgštis gali būti normali DNR seka.

Buvo pranešta apie kelis lipofekcijos in vivo metodus. Visiems gyvūnams lipidų-nukleorūgščių agregatas gali būti švirkščiamas į kraują, tiesiai į audinį, į pilvaplėvę, įlašinamas į trachėją arba paverčiamas aerozoliu, kuriuo gyvūnas kvėpuoja. Zhu ir kt., Science 261, 209-211 (1993) aprašo vieną intraveninę 100 mikrogramų DNR ir DOTMA: dioleoilfosfatidiletaanolamino injekciją į veną, kuri veiksmingai transfekavo praktiškai visus audinius. Nabel ir kt., Supra, naudojo kateterį, kad implantuotų liposomų-DNR agregatus į kraujagyslių sieneles, todėl buvo sėkmingai transformuoti keli ląstelių tipai, įskaitant endotelio ir kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles.

Stribling ir kt., Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 89, 11277-11281 (1992), parodė, kad chloramfenikolio acetiltransferazės (CAT) ekspresijos plazmidės, susietos su katijoninėmis liposomomis, aerozolio tiekimas pelėms sukėlė aukšto lygio, plaučiams būdingą CAT geno ekspresiją in vivo mažiausiai 21 dieną. Jie aprašė tokią procedūrą: Šeši miligramai plazmidės DNR ir 12 μmol DOTMA/DOPE liposomų buvo praskiedžiami vandeniu iki 8 ml, o vienodi tūriai sumaišomi į du „Acorn I“ purkštuvus (Marquest, Englewood, Colo.). į „Intox“ mažų gyvūnų poveikio kamerą (Albukerkė) ir aerozoliui generuoti buvo panaudotas 4 L/min oro srautas (šiam tūriui aerozolizuoti reikėjo apie 90 min.) gyvūnai buvo pašalinti iš kameros 1–2 valandoms ir procedūra buvo pakartota. Šis protokolas atspindi aerozolio tiekimo metodą.

Šie pavyzdžiai pateikiami tik iliustraciniais tikslais ir nėra skirti ar neturėtų būti aiškinami, kad bet kokiu būdu apribotų išradimą.

O-metilo ir O-etilfosfatidilcholino sintezė

Fosfatidilcholinas buvo gautas kaip CHCl3 tirpalas (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, Ala.). Metiltrifluormetansulfonatas ir etil -trifluormetansulfonatas buvo gauti iš „Aldrich Chemical Co.“ (Sent Luisas, Mo.) ir prieš naudojimą distiliuojami. Prieš naudojimą etilo eteris buvo distiliuotas iš ličio aliuminio hidrido.

Triflato esteris (1,0 mmol) lašinamas į fosfatidilcholino (1,0 mmol) tirpalą 20 ml etilo eterio, maišant azoto atmosferoje. Plono sluoksnio chromatografinė analizė (SiO2, 65: 25: 4 CHCl3 : CH3 O: H2 O aptikimas naudojant fosfomolibdato purškimą) parodė visišką fosfatidilcholino konversiją (R.f = 0,25) iki alkilo PC + (Rf = 0,60) per 30 minučių. Reakcijos mišinys buvo pilamas ant SiO pagalvėlės2 (4 cm skersmens ir 2 cm aukščio) ir eteris ištraukiamas per siurbimo vakuumą. SiO2 trinkelė buvo plaunama 3 kartus 10 ml CHCl porcijomis3 : CH3 Oi (10: 1). Produkto turinčios frakcijos buvo sujungtos ir išgarintos vakuume.

Metilo fosfotristeris buvo gautas 85% išeiga. Etilo fosfotristeris buvo gautas 80% izoliuoto derlingumo po 4 valandų reakcijos.

Analizuojant fosfatidilcholino metilfosfotesterį 600 MHz dažniu 1H-NMR, deltos 3,85 atrado dubletų porą (3H, J = 12 Hz), būdingą numatomam diastereomeriniam fosfato metilesterių mišiniui.

Liposomų metabolizmas ir stabilumas

Šių katijoninių lipidų metabolizmas buvo tiriamas naudojant fluorescencinį darinį 9. Pelės L-ląstelių kultūros buvo apdorotos fluorescenciniu dariniu 9, su DNR ir be jos, kaip ir standartinė transfekcijos procedūra, atlikta 3 pavyzdyje. Po 24 valandų inkubacijos ląstelės buvo nubraukiamos nuo plokštelės ir centrifuguojamos, kad būtų izoliuotos kaip šlapios granulės. Lipidai buvo išgauti iš ląstelių mililitrais chloroformo: metanolio (2: 1). Ekstrakto apatinė chloroformo fazė buvo pašalinta ir sukoncentruota. Plonasluoksnė chromatografija (TLC) iš koncentruoto ekstrakto ant silikagelio plokštelių naudojant chloroformą: metanolį: vandenį (65: 25: 4) atskleidė pagrindinę vietą pirminio fluorescencinio lipido padėtyje ir antrą, mažiau intensyvią vietą su Rf tai buvo maždaug taip, kaip tikėtasi 12-NBD-aminodekano rūgšties atveju. Remiantis santykiniu dviejų dėmių fluorescenciniu intensyvumu, maždaug trečdalis pradinio junginio buvo hidrolizuota maždaug per laiką, reikalingą tipinei kultivuotų ląstelių transfekcijai.

Jei nėra ląstelių, vandeninis EtPC + (3) yra gana stabilus, naudojant plono sluoksnio chromatografiją, išmatuotas skilimas nepastebimas po kelių dienų kambario temperatūroje. Mėginiai buvo laikomi chloroforme -20 ° C temperatūroje daugiau nei 2 metus, be jokių skilimo požymių.)

Siekiant toliau tirti šių lipidų metabolizmą, 9 buvo apdorotos išgrynintomis fosfolipazėmis, gautomis iš įvairių šaltinių, laikantis standartinių procedūrų. W. W. Christie, Lipidų analizė (2 -asis leidimas, Pergamon Press, Oksfordas, 1982). Paprastai 50–100 mikrogramų 9, esant 50–250 μl etilo eterio, buvo suplakta su 50–250 μl fermento buferiniame tirpale, kuriame, jei tinka fermento funkcijai, yra kalcio chlorido. Tam tikrais intervalais buvo paimti keli mikrolitrų mėginiai TLC analizei, naudojant silikagelio plokštes, naudojant chloroformą: metanolį: vandenį arba chloroformą: metanolį: koncentruotą amoniaką, abu 65: 25: 4. Nepastebėta jokios reakcijos su Clostridium perfringens fosfolipaze C. Fosfolipazė D, gauta iš kopūstų, Briuselio kopūstų, žemės riešutų ir Streptomyces chromofuscus, labai lėtai skaidosi 9, palyginti su PC. Visi fermentai, išskyrus tuos, kurie buvo išgauti iš Briuselio kopūstų (mūsų), buvo komerciniai preparatai, gauti iš „Sigma“ (Sent Luisas, Mo.).

Fosfolipazės D poveikio produktas 9 dar nėra tiksliai nustatytas, nors akivaizdu, kad tai nėra nei 1, nei fosfatidinė rūgštis. Gali būti, kad produktas yra fosfatidiletanolis, atsižvelgiant į jo chromatografines savybes. Taigi cholino grupė nėra taip lengvai prarandama nuo 9 kaip fosfatidilcholino, veikiant naudojamam fermentui.

Gydant fosfolipaze A2 (Naja naja), susidarė 12- (NBD-amino) dodekano rūgštis, nors ir kelis kartus lėčiau, nei pastebėta PC kontrolinėje reakcijoje. Taigi ląstelinis EtPC + (3) metabolizmas gali vykti fosfolipazės A sukelta hidrolize, o cholino dalis prarandama daug lėčiau dėl fosfolipazės D veikimo, nors akivaizdu, kad į tokią išvadą reikia žiūrėti atsargiai, nes gali atsirasti ląstelių lipazės skirtingos veiklos nei tos, kurios naudojamos mūsų in vitro tyrimuose.

Kultivuotų L ir Rcho-1 ląstelių lipofekcija

Pelės L ląstelės buvo auginamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje su 10% veršelių serumu, 100 V/ml penicilino, 100 μg/ml streptomicino ir glutamino. Rcho-1 ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpėje, kurioje buvo 10% karščiu inaktyvuoto veršelio vaisiaus serumo, 50 μM 2-merkaptoetanolio, 1 mM natrio piruvato, 100 V/ml penicilino ir 100 μg/ml streptomicino. Abi ląstelių linijos buvo auginamos 37 ° C temperatūroje 5% CO2 atmosfera.

CH3 Cl3 lipido tirpalas buvo išdžiovintas vakuume ir suspenduotas steriliame H2 O esant 10 mg/ml (NBD pažymėtas lipidas buvo suspenduotas 1 mg/ml koncentracijoje dėl riboto tirpumo), sukant sūkurį. Ši suspensija buvo apdorota ultragarsu 30 sekundžių, naudojant „Branson 400W“ ultragarso mikroskopą, esant mažiausiai galiai. Ši suspensija buvo praskiesta iki 1 mg/ml ir toliau apdorota ekstruzijos būdu per 1000 Å ultrafiltrą, kad gautųsi vienalytės liposomos.

Vandeninė liposomų suspensija (80 μg lipidų) buvo sumaišyta su 10 μg RSV-CAT DNR ir 20 minučių laikoma aplinkos temperatūroje. Ląstelės buvo plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu, o terpė buvo pakeista DME arba RPMI. Kai liposomų ir DNR mišinyje susidarė drumstos baltos nuosėdos, tirpalas lašinamas į ląsteles. Tada plokštelės švelniai sukamos ir inkubuojamos 10–24 val. 37 ° C temperatūroje, esant 5% CO2. Terpė buvo pakeista visa terpe, o ląstelės buvo surinktos praėjus 48 valandoms po DNR pridėjimo. Transfekcijos, susijusios su „LIPOFECTIN“ (naudojant 30 μg), buvo atliktos pagal paskelbtas „Gibco-BRL“ procedūras. Ląstelių ekstraktai buvo paruošti ir ištirti dėl chloramfenikolio acetiltransferazės ir luciferazės aktyvumo. Autoradiograma pateikta fig. 2. Toliau pateiktoje lentelėje nurodomi transfekuojantys reagentai kiekvienoje juostoje, pavaizduotoje Fig. 2 autoradiograma:

______________________________________
Ląstelių tipo juostos reagentai
______________________________________

Pelė L 1 000 Å pūslelė EtPC + (3)
2 1000 Å pūslelių EtPC + (3) + RSV-CAT DNR
3 ultragarsu apdorota EtPC + (3) + RSV-CAT DNR
4 "LIPOFECTIN" + RSV-CAT DNR
Rcho-1 5 1000 Å pūslelė EtPC + (3) + RSV-CAT DNR
6 ultragarsu apdorota EtPC + (3) + RSV-CAT DNR
7 „LIPOFECTIN“ + RSV-CAT DNR
______________________________________

Kaip matyti iš autoradiogramos, EtPC + (3) yra toks pat veiksmingas transfekuojantis agentas kaip „LIPOFECTIN“.

Laikydamiesi to paties protokolo, mes ištyrėme santykinį NBD pažymėto lipido (9) ir EtPC + (3) transfekcijos efektyvumą. Buvo panaudota 10 μg RSV-CAT ir 80 μg lipidų. Rezultatai parodyti fig. 3. Šioje lentelėje nurodomas eismo juostų turinys:

______________________________________
Lipidų juosta
______________________________________

1 nėra lipidų
2 NBD-PC
3 EtPC +
4 1: 1 EtPC + /NBD-EtPC +
5 NBD-EtPC +
______________________________________

Rezultatai pateikti fig. 3 parodyta, kad NBD pažymėti lipidai (11) tarpininkauja šiek tiek geriau nei EtPC + (3). Tai rodo, kad riebalų rūgščių pakaitų pobūdis vaidina svarbų vaidmenį nustatant DNR transfekcijos efektyvumą.

Kultivuotų kūdikių žiurkėnų inkstų ir Niemann-Pick (A tipo) lipofekcija

EtPC + (3) buvo naudojamas baltymo RAB-7 genui transfekuoti. Sukurtas vektorius, turintis RAB-7 geną ir T7 polimerazės promotorių.Jis buvo transfekuotas į kūdikio žiurkėno inkstą ir Niemann-Pick (A tipo) ląsteles. Ląstelės vienu metu buvo užkrėstos rekombinantiniu vakcinos virusu, turinčiu T7 polimerazę. EtPC + (3) ir DNR santykis buvo 5: 1 pagal masę. RAB-7 geno ekspresija buvo nustatyta matuojant ląsteles, nudažytas antikūnais prieš RAB-7 baltymą. Naudotomis sąlygomis (kurios nebuvo optimizuotos EtPC +), transfekcijos efektyvumas (matuojamas pagal RAB-7 geną ekspresuojančių ląstelių procentą) buvo 30–40% BHK ląstelių ir apie 20% fibroblastų. Šie rezultatai buvo labai panašūs į gautus naudojant komercinį produktą „LIPOFECTIN“.

Kultivuotos žmogaus eritroleukemijos (K562) ląstelių lipofekcija

Kultivuotų žmogaus eritroleukemijos (K562) ląstelių lipofekcija naudojant EtPC + (3) buvo lyginama su „LIPOFECTIN“. 10 arba 50 μg EtPC + (3) arba 30 μg "LIPOFECTIN" buvo sumaišyti su 5 μg pRSV-CAT arba po 5 μg pGAL4-HSF1 ir pGAL4-CAT. Tada į ląsteles buvo pridėtas lipidų-DNR agregatas. Po 48 valandų ląstelės buvo ištirtos pagal CAT aktyvumą, naudojant įprastą chromatografinį radijo tyrimą. Vizualiai ištyrus autoradiogramą, EtPC + (3) ir „LIPOFECTIN“ transdukcijų rezultatai buvo labai panašūs.

Sveikų gyvūnų lipofekcija

Norint lipofektuoti visus gyvūnus, galima naudoti bendrą Zhu ir kt., Supra, procedūrą. 20 g gyvūno svorio į veną švirkščiama 100 μg DNR kaip tinkamas vektorius, sujungtas su maždaug 600 μg katijoninio lipido. Tikimasi, kad norint gauti optimalius rezultatus, reikės keisti DNR kiekį ir katijoninių lipidų bei DNR santykį ir įvertinti kiekvieno kiekio ir santykio norimą požymį. Lipidai išsisklaido taip pat, kaip ir transfekuojant in vitro.

Norint nustatyti dozę ir pageidautina gydyti konkrečius audinius ar organus, gali būti taikomos įvairios procedūros, pavyzdžiui, injekcijos tiesiai į organą ar audinį, pristatymas kanalu arba injekcija į kanalus, kraujagysles ar kanalus, vedančius į dominantį organą ar audinį, arba tepant paviršių rankiniu būdu arba per aerozolio garus, pavyzdžiui, į plaučius.


Žiūrėti video įrašą: #IronAcademy: Mitybos pagrindai NAUJOKAMS ir ne tik. Baltymai, angliavandeniai, riebalai (Sausis 2022).