Informacija

12.5: Aminorūgščių kaip biosintezės pirmtako naudojimo pavyzdžiai - Biologija


12.5. Aminorūgščių kaip biosintezės pirmtako naudojimo pavyzdžiai

Aminorūgščių homeostazė ir signalizacija žinduolių ląstelėse ir organizmuose

Ląstelėse nuolat keičiasi baltymai, kurie laikui bėgant perdirba daugumą aminorūgščių. Grynuosius nuostolius daugiausia lemia aminorūgščių oksidacija. Homeostazė pasiekiama keičiant nepakeičiamas aminorūgštis su nepakeičiamomis amino rūgštimis ir perkeliant amino grupes iš oksiduotų aminorūgščių į aminorūgščių biosintezę. Ši homeostatinė būklė palaikoma per aktyvų mTORC1 kompleksą. Esant aminorūgščių išeikvojimui, mTORC1 yra inaktyvuotas. Tai padidina ląstelių baltymų skilimą per autofagiją ir sumažina baltymų biosintezę. Be to, gali būti aktyvuotas bendras nenuslopinamas 2/ATF4 kontrolės kelias, dėl kurio transkribuojami genai, susiję su aminorūgščių transportavimu ir neesminių aminorūgščių biosinteze. Metabolizmas yra automatiškai reguliuojamas, kad būtų sumažinta aminorūgščių oksidacija. Sisteminis amino rūgščių lygis taip pat yra griežtai reguliuojamas. Maistas trumpam padidina aminorūgščių kiekį plazmoje, o tai skatina insulino išsiskyrimą ir nuo mTOR priklausomą baltymų sintezę raumenyse. Aminorūgščių perteklius oksiduojamas, todėl padidėja karbamido gamyba. Trumpalaikis badavimas nesukelia plazmos aminorūgščių dėl sumažėjusios baltymų sintezės ir autofagijos atsiradimo. Kadangi pusė visų amino rūgščių yra nepakeičiamos, baltymų sintezės sumažinimas ir aminorūgščių oksidacija yra vienintelės dvi priemonės, mažinančios aminorūgščių poreikį. Dėl ilgalaikės mitybos trūkumo sumažėja aminorūgščių kiekis plazmoje. Atrodo, kad CNS sukelia specifinį baltymų atsaką, kai išeikvojamos aminorūgštys, todėl išvengiama netinkamos dietos. Priešingai, didelis baltymų kiekis kartu su kitomis maistinėmis medžiagomis mažina suvartojamo maisto kiekį.


Kas yra amino rūgštys?

Maiste esančios amino rūgštys sudaro baltymus. Kai baltymai virškinami, jie vėl suskaidomi į specifines aminorūgštis, kurios vėliau atrenkamos įvairiems tikslams. Šie nauji organizme susidarę baltymai sudaro didžiąją kūno dalį: odą, akis, širdį, žarnyną, kaulus ir, žinoma, raumenis.

Štai kodėl suprasti, ką gali kiekvienas iš šių aminorūgščių, ir gauti daugiau jų į savo mitybą gali būti labai naudinga siekiant konkrečių tikslų, pavyzdžiui, raumenų auginimo. Žinoma, nereikia perdėti, nes geras baltymų balansas yra tai, kas suteikia sveikatos ir stabilumo, be jo bet kuri amino rūgštis gali tapti toksiška.

Ši problema buvo iškelta fenilalanino atveju, bet galioja visoms amino rūgštims. Siekiant išvengti galimo žalingo poveikio, svarbu gauti pakankamai vitaminų ir mineralų, nes jie užtikrina tinkamą baltymų pavertimą amino rūgštimis ir atvirkščiai.

Priklausomai nuo to, su kuo kalbate, yra apie 20–22 standartines amino rūgštis. Iš tų 20–22 iš jų 8–10 yra laikomi esminiais, o tai reiškia, kad norint, kad jie tinkamai veiktų, turite gauti tam tikrą jų kiekį savo dietoje - mūsų kūnas negali jų sintetinti iš kitų medžiagų, todėl mes gauname juos tik iš maisto .

Kadangi aminorūgštys yra baltymų statybiniai blokai, esu tikras, kad jų gausite daug, tačiau šis straipsnis parodys papildomo papildomo laisvo pavidalo aminorūgščių papildymo naudą ir išsamiai paaiškins, kas per daug ar per mažai. Keli iš jų gali padaryti, ką jie daro organizme ir kiek ir kada turėtumėte juos naudoti.

Šalia aštuonių nepakeičiamų aminorūgščių yra apie 14 nepakeičiamų aminorūgščių ir daugybė kitų metabolitų, klasifikuojamų kaip aminorūgštys, gautos iš 8 esminių. Šalia aštuonių esminių aminorūgščių pabandysiu aptarti keletą jų, pastaruoju metu pasirodžiusių antraštėse: L-glutaminas, L-argininas, L-karnitinas, L-cisteinas ir HMB.


Aminorūgštys augaluose: reguliavimas ir funkcijos vystantis ir apsaugant nuo streso

Gana ilgą laiką aminorūgščių apykaitos tyrimams buvo skiriamas tik ribotas dėmesys augalų fiziologijos ir biochemijos srityse. Dėl esminės amino rūgščių funkcijos baltymų sintezėje buvo viliojanti manyti, kad augalai amino rūgštis naudoja ir metabolizuoja taip pat, kaip ir.

Gana ilgą laiką aminorūgščių apykaitos tyrimams buvo skiriamas tik ribotas dėmesys augalų fiziologijos ir biochemijos srityse. Dėl esminės amino rūgščių funkcijos baltymų sintezėje buvo viliojanti manyti, kad augalai amino rūgštis naudoja ir metabolizuoja taip pat, kaip ir mikroorganizmai ar žmonės. Tačiau augalai, būdami visiškai autotrofiniai organizmai, susiduria su iš esmės skirtingais iššūkiais, palyginti su organizmais, kurie gyvena iš augalų (ar dumblių) pagamintos biomasės. Be to, augalai pažodžiui gamina šimtus baltymų neturinčių aminorūgščių arba iš aminorūgščių gautų antrinių metabolitų, todėl jiems reikia labai skirtingos reguliavimo sistemos, kuri koordinuotų pirminio ir antrinio metabolizmo poreikius. Aminorūgščių metabolizmo pasiskirstymas tarp šaknų ir antžeminių organų arba tarp skirtingų tarpląstelinių skyrių prideda dar vieną sudėtingumo lygį, dar labiau atskiriantį augalus nuo prokariotų ar gyvūnų.

Žmogaus mitybos požiūriu įdomiausios yra aminorūgštys, kurių patys negalime sintetinti. Atitinkamai pastangos suprasti „Lys“, „Met“ ir „Trp“ biosintezės kelius ir reguliavimą paskatino augalų aminorūgščių tyrimus, nes šių trijų amino rūgščių dažnai yra ribotai. Žvelgiant iš žemės ūkio perspektyvos, buvo ištirti ir naudojami herbicidams kurti aminorūgščių biosintezės keliai, kurie yra išskirtinai augaluose.

Šiuo metu dėl klimato kaitos ir požeminio vandens užteršimo perteklinio azoto trąšų pavojaus reikia iš naujo sutelkti savo pastangas. Optimalus produktyvumas šiuo metu pasiekiamas masiškai tręšiant azoto turinčiomis trąšomis, tačiau jį riboja augalų efektyvumas sugeriant, paskirstant, laikant ir pasisavinant azotą, o visus šiuos procesus reguliuoja aminorūgščių apykaita ir transportavimas. Panašiai daugelis augalų gynybinių reakcijų nuo biotinio ar abiotinio streso apima aminorūgščių metabolizmo koregavimą, siekiant tiesiogiai neutralizuoti žalingą poveikį aplinkai arba suteikti gynybinių junginių pirmtakų. Keletas aminorūgščių tampa svarbiomis signalinėmis molekulėmis, kurios organizuoja augalų augimą ir vystymąsi, integruojant augalo metabolinę būseną į aplinkos signalus, ypač esant stresinėms sąlygoms. Tačiau mūsų žinios apie aminorūgščių apykaitą, mechanizmus, reguliuojančius laisvųjų aminorūgščių kiekį ir įvairias amino rūgščių funkcijas augaluose, toli gražu nėra baigtos.

Šios tyrimų temos tikslas yra surinkti įvairių aminorūgščių metabolizmo, transportavimo ar signalizavimo aspektų indėlį, kad būtų galima sujungti ir integruoti į išsamų vaizdą naujausius mūsų supratimo apie įvairias aminorūgščių funkcijas augaluose pasiekimus. Laukiami visų tipų straipsniai, susiję su šia augalų fiziologijos sritimi, įskaitant originalius tyrimus, apžvalgas, mini apžvalgas, metodus, komentarus ir nuomones.

Raktažodžiai: Aminorūgščių metabolizmas, amino rūgščių transportavimas, atsakas į stresą, azoto jutimas, signalizavimas ir įsisavinimas, azoto naudojimo efektyvumas, pasėlių gerinimas

Svarbi pastaba: Visi įnašai į šią tyrimų temą turi patekti į skyrių ir žurnalą, kuriam jie pateikiami, kaip apibrėžta jų misijos pareiškimuose. „Frontiers“ pasilieka teisę bet kokiame tarpusavio vertinimo etape nukreipti neaprašytą rankraštį į tinkamesnį skyrių ar žurnalą.


Rezultatai

Pirminis šlapimo išsiskyrimo modelių įvertinimas

Iš pradžių 1 etapui iš plačiosios visuomenės buvo įdarbinti 172 dalyviai (18 metų ar vyresni). Galutinė tyrimo grupė, sudaryta iš 151 tiriamojo, pateikė šlapimo mėginius ir išsamius atsakymus į klausimynus ir pranešė, kad neturi jokių svarbių sveikatos sutrikimų. Dalyvių grupę sudarė 99 vyrai, kurių amžiaus vidurkis 29,5 ± 11,8 (vidurkis ± SD), ir 52 moterys, kurių amžiaus vidurkis 35 ± 13,7. Pirmajame tyrimo etape buvo įvertintas 151 įdarbintojo šlapimo išsiskyrimo profilis prieš papildymą. Aminorūgščių kompozicijos buvo nustatytos atliekant GC-FID analizę ir panaudotos 29 aminorūgščių ir aminorūgščių darinių santykinio procentinio gausos duomenų rinkiniui generuoti. Šie duomenys buvo įvertinti naudojant k-vidurio grupavimo metodus, siekiant nustatyti, ar tyrimo dalyviai gali būti suskirstyti į tris grupes, remiantis aminorūgščių santykiniu kiekiu, o minimali klasterio sudėtis yra n & gt 10. Tada buvo atlikta standartinė diskriminacinių funkcijų analizė, siekiant nustatyti, ar kiekvienos grupių aminorūgščių profiliai yra labai skirtingi (Vilkso lambda = 0,13, F (46,252) = 9,85, p & lt 0,0001), kaip parodyta kanoniniame brėžinyje (2 pav.) su glicino ir histidino kiekiais, kurie yra pagrindinė grupių diskriminacija. Kiekvienos grupės nariai buvo glaudžiai sugrupuoti pagal jų šlapimo išsiskyrimo profilius ir kiekvienas pogrupis buvo aiškiai išspręstas iš kitų pogrupių su minimaliu persidengimu.

Diskriminacinės funkcijos kanoninis pogrupių brėžinys, sukurtas naudojant k-vidurio grupes

Septyniolika aminorūgščių padėjo diferencijuoti grupių sudėties profilius, nes pogrupių santykinis gausumas labai skiriasi, o pagrindinių komponentų koncentracija buvo apibendrinta 2 lentelėje. Histidinas ir glicinas buvo gausiausios amino rūgštys šlapimo profiliuose ir rodomas skirtingas santykinis kiekvienos iš trijų grupių gausumas. 1 klasteriui būdingas aukštas histidino ir glicino santykis 2,0, 2 grupėje rodomas mažas 0,4 santykis, o 3 grupėje lygiaverčiai lygiai, todėl santykis yra 1,0. 1 klasteryje buvo didžiausia bendra išskiriamų aminorūgščių koncentracija šlapime, kur histidino kiekis buvo 2,4–3,6 karto didesnis nei atitinkamai 3 ir 2 klasteriuose. 1 grupėje taip pat buvo žymiai didesnė glutamino, tirozino ir šakotosios grandinės aminorūgščių koncentracija, palyginti su 2 ir 3 klasteriais. Be to, 1 grupėje serino ir alanino buvo daugiau nei 3 grupėje (2 lentelė). 2 klasteris pagal šiuos parametrus buvo lygus 3 klasteriui, tačiau aiškiai išsiskyrė dėl didelio glicino išsiskyrimo su šlapimu lygio.

Objektyvus skaidymas k būdu reiškia subjektų grupavimą, pagrįstą jų šlapimo išskyrimo profilio panašumais, pašalino vartotojų šališkumą paskirstant grupes. 3 grupėje buvo didžiausias narystės dažnis (46%), po to - 1 klasteris (32%), o paskui 2 klasteris (22%), kaip parodyta 2 lentelėje. Trys tyrimo grupės pogrupiai turėjo panašias KMI reikšmes ir daugiausia buvo kaukazietiški. 1 ir 3 grupių vidutinis amžius buvo panašus, tačiau 2 grupės vidutinis amžius buvo žymiai didesnis nei abiejų 1 ir 3 grupių. Lytis nebuvo vienodai subalansuota trijose grupėse, kuriose 2 grupėje daugiausia buvo moterų (p & lt 0,05). Šešiolika iš 27 vyrų, kurie prisistatė sportininkais, buvo priskirti 1 klasei, dešimt - 3 klasei ir tik vienas - 2 grupei. Visoje tyrimo grupėje, kurioje vyrai (n = 99) vidutinis lygis buvo 5185 ± 290 μmol/L (vidurkis ± SEM), o patelių (n = 52) 4955 ± 452 μmol/l. Palyginus vyrų ir moterų aminorūgščių šlapimo sudėtį, buvo pastebėti reikšmingi glutamo rūgšties skirtumai (vyrų 16,7 ± 2, o moterų - 25,0 ± 3 μmol/L, p & lt 0,05), glicino-prolino dipeptidas (78,0 ± 5, palyginti su 54,7 ± 6 μmol/L, p & lt 0,01), prolino-hidroksiprolino dipeptidas (234,3 ± 15, palyginti su 154,7 ± 19 μmol/l, p & lt 0,01) ir tirozino (96,8 ± 7, palyginti su 72,8 ± 9 μmol/l, p & lt 0,05).

Nuovargio lygiai buvo įvertinti naudojant Chalderio nuovargio skalę [26], kur vidutinis bendras nuovargio balas buvo apskaičiuotas kaip 13,6 ± 5,9 (vidurkis ± SD) visai grupei. Tačiau įvertinus grupes paaiškėjo, kad 2 klasterio bendras nuovargis buvo žymiai didesnis, lyginant su 1 klasteriu, o 1 ir 3 grupių balai buvo panašūs (2 lentelė). Chalderio nuovargio skalės rezultatus atspindėjo nuovargio indekso rezultatai, gauti iš bendro sveikatos klausimyno. 2 grupė taip pat pranešė apie didesnį simptomų lygį, įvertintą pagal miego indeksą, palyginti su 1 grupe.

Buvo atlikta koreliacijos analizė, siekiant įvertinti galimas sąsajas tarp šlapimo metabolitų lygio ir įvairių simptomų indeksų kiekvienoje grupėje. Kiekvienoje grupėje buvo pastebėti saviti koreliacijų masyvai, turintys stiprių teigiamų asociacijų (r & gt .50), pastebėtas 1 klasterio patelėms (3 lentelė). Tai buvo akivaizdu moterims, priklausančioms 1 grupei (n = 13) kad didesnė glutamo rūgšties, hidroksilizino, metionino, ornitino, prolino ir valino koncentracija šlapime buvo teigiamai koreliuojama su Chalderio fizinio nuovargio balo reikšmėmis (r & gt .55, p & lt 0,05). Toje pačioje grupėje didėjantys virškinimo trakto rodikliai buvo labai stipriai susiję su didesniu prolino kiekiu šlapime (r = 0,92), metioninas (r = .82) ir valinas (r = .70). Šios aminorūgštys taip pat buvo koreliuojamos su daugeliu kitų simptomų, kaip parodyta 3 lentelėje. 2 grupių patelės turėjo teigiamą dviejų aminorūgščių koreliaciją, kai asparagino koncentracija šlapime buvo susijusi su virškinimo trakto indeksu, o prolinas - su visais keturiais nuovargio priemonės ir virškinimo trakto indeksas. Priešingai, 3 klasterio patelės turėjo neigiamą ryšį tarp bendro nuovargio ir alanino, asparto rūgšties, izoleucino, fenilalanino ir tirozino. 1 grupės vyrai parodė devynias neigiamas aminorūgščių ir simptomų koreliacijas, iš kurių septyni buvo susiję su virškinimo trakto indeksu (4 lentelė). Patinai iš 2 grupės turėjo teigiamą ryšį tarp α-aminosviesto rūgšties ir keturių nuovargio indeksų. Patinai iš 3 grupės turėjo šešis simptomų indeksus (visi keturi nuovargio rodikliai, skausmas ir gyvybingumas), teigiamai susiję su β-aminoizobutyro rūgštimi ir neturėjo neigiamos koreliacijos.

Aminorūgščių papildymo įvertinimas

Papildymo tyrimo atitiktis buvo 51%, kai 37 dalyviai sėkmingai baigė bandymą, vartodami aminorūgščių papildą 25–30 dienų laikotarpiui, taip pat grąžindami bendrosios sveikatos klausimynus ir pateikdami šlapimo mėginius po papildymo. Papildoma bandomoji grupė (n = 37) sudarė 10 moterų ir jų amžiaus vidurkis buvo 33,8 metų, nuo 19 iki 65 metų.

Nuovargio lygis buvo įvertintas naudojant Chalderio nuovargio skalę [26] ir bendrą nuovargio indeksą, kurį sukūrė dabartinė tyrimų grupė, kur mažesni balai rodė mažesnį abiejų priemonių nuovargio lygį. Pasibaigus papildomam tyrimui, 30 iš 37 dalyvių grupės (81%) pranešė apie pagerėjusį nuovargį. Buvo pastebėtas reikšmingas visos kohortos bendro nuovargio balų sumažėjimas nuo 13,4 ± 0,8 (vidurkis ± SEM) iki 8,8 ± 0,6 (Wilcoxon suderintų porų testas, p & lt 0,0001) po papildymo. Bendra sveikata ir savijauta taip pat buvo vertinama naudojant 86 punktų klausimyną, iš kurio sudaryti keli indeksai (1 lentelė). Taškai buvo standartizuoti pagal vertes iš 40, kur „0“ balas rodė, kad tiriamasis nebuvo paveiktas jokių simptomų, apimančių tą indeksą, ir „40“ balas, rodantis, kad tiriamasis patyrė visus simptomus indeksų grupę. Po papildymo pastebimai sumažėjo anketų balai, rodantys galimus nuovargio, miego ir gyvybingumo indeksų pagerėjimus (5 lentelė). Atsakydami į klausimus, susijusius su jų patirtimi naudojant priedą, 25 respondentai (68%) nurodė, kad, jų manymu, papildas pagerino jų sveikatą, o 28 (76%) teigė, kad, jei bus suteikta galimybė, ir toliau vartos papildą.

Septyni dalyviai, kurie nepranešė apie nuovargio pagerėjimą, buvo visi vyrai, kurių vidutinis Chalder nuovargio balas prieš papildymą buvo 10,0 ± 1,4 (vidurkis ± SEM), o likusios grupės (n = 30) vidurkis buvo žymiai didesnis Chalderio nuovargio balas 14,2 ± 0,8 (Mann-Whitney U testas, p & lt 0,02). Dalyviai, kuriems pasireiškė nuovargio pagerėjimas, prieš pradedant papildyti, turėjo didesnį nuovargį. Didesnė grupė, kuri pranešė patyrusi nuovargio palengvėjimą, galiausiai pranešė, kad nuovargis po papildymo buvo žymiai mažesnis (8,1 ± 0,6, vidurkis ± SEM) nei tie, kurie nepranešė apie pagerėjusį nuovargį (11,7 ± 1,4, p & lt 0,04). Šeši iš septynių vyrų, kurie nereagavo į aminorūgščių papildymą, buvo klasifikuojami pagal jų šlapimo profilį prieš papildymą kaip priklausantys 3 klasteriui, o septintasis atsakas nereaguojantis buvo priskirtas 1 grupei.


Išvados

Čia mes ištyrėme kodono ir aminorūgščių naudojimą kriketo modelio sistemoje ir pasiūlėme svarbų atrankos vaidmenį jo labiausiai transkribuotuose genuose, viso organizmo lygiu (1 lentelė) ir skirtinguose audinių tipuose (1 papildomas failas: lentelė) S2). Būsimi tyrimai turėtų apimti tiesioginį tRNR kiekybinį įvertinimą skirtinguose audinių tipuose [39, 48, 74, 113], siekiant įvertinti, ar šie rezultatai papildo išvadą apie panašų santykinį tRNR gausą tarp audinių tipo ir lyties šiame krikete. Toks požiūris taip pat padės išsiaiškinti, kodėl ši kriketų rūšis gali turėti mažesnį polinkį į su audiniais susijusius optimalius kodonus nei kiti iki šiol ištirti organizmai [20, 36, 38, 40]. Nors mūsų duomenys rodo, kad mutaciniai AT šališkumai gali iš dalies prisidėti prie genomo masto kodono naudojimo modelių G. bimaculatus, ir neatmetame BGC vaidmens keičiantis genų GC/AT turiniui, kolektyviniai modeliai atitinka hipotezę, kad transliacinė atranka žymiai prisideda prie optimalaus kodono naudojimo esant aukštai transkripcijai. Tolesniuose tyrimuose turėtų būti kruopščiai įvertintas galimas BGC vaidmuo šios kriketo rūšies naudojime kodonu [85], įskaitant metodus, kuriuose atsižvelgiama į mejozinio rekombinacijos greitį, ekspresijos lygį meiotinėse ląstelėse ir jų ryšį su GC (taigi ir AT) turiniu (plg. 83, 114, 115]), nes šiame taksone pradeda atsirasti daugiau genominių, populiacijos ir rekombinacijos duomenų.

Kita reikšminga būsimo tyrimo kryptis gali apimti kodonų pakilimo į CDS nustatymą [116], kuris gali sulėtinti vertimą, ypač CDS pradžioje, ir gali padidinti vertimo efektyvumą pasroviui nuo rampos [26, 45, 51, 52, 116]. Visų pirma, rampos, kuriose naudojami kodonai su Nonopt-kodonu↓ tRNR ir Opt-kodonasklibėti čia nurodyta būsena (1 lentelė) yra kandidatai, atliekantys vaidmenį reguliuojant vertimo pailgėjimo greitį, naudojant CDS, ir gali skirtis priklausomai nuo didelės ir mažos išraiškos. Be to, naujausi tyrimai rodo, kad kodono naudojimas ir vandenilio surišimo rampos gali turėti įtakos dsDNR išvyniojimui ir transkripcijos reguliavimui, kaip nustatyta bakterijose ir archeose (bet ne grybuose) [117], taigi tai taip pat suteikia prasmingą kelią tolesniems šios srities tyrimams. kriketo modelis ir kiti daugialąsčiai gyvūnai. Galiausiai reikėtų atlikti tolesnius optimalių ir neoptimalių kodonų dažnio ir jų santykių su tRNR gausos ir genų funkcijų tyrimus platesniame daugialąsčių organizmų spektre. Tokie tyrimai atskleis, ar čia pastebėti reiškiniai yra bendri skirtingoms sistemoms.


Ką reikia žinoti apie nepakeičiamas amino rūgštis?

Norint išlaikyti gerą sveikatą ir normalų funkcionavimą, organizmui reikia 20 skirtingų amino rūgščių. Žmonės turi gauti devynias iš šių amino rūgščių, vadinamų nepakeičiamomis amino rūgštimis, su maistu. Geri mitybos šaltiniai yra mėsa, kiaušiniai, tofu, soja, grikiai, kvinoja ir pieno produktai.

Aminorūgštys yra junginiai, kurie sudaro baltymus. Kai žmogus valgo maistą, kuriame yra baltymų, jo virškinimo sistema skaido baltymus į amino rūgštis. Tada kūnas įvairiais būdais sujungia amino rūgštis, kad atliktų kūno funkcijas.

Sveikas kūnas gali gaminti kitas 11 aminorūgščių, todėl jų paprastai nereikia patekti į organizmą su maistu.

Aminorūgštys stato raumenis, sukelia chemines organizmo reakcijas, perneša maistines medžiagas, užkerta kelią ligoms ir atlieka kitas funkcijas. Aminorūgščių trūkumas gali sukelti imuniteto sumažėjimą, virškinimo sutrikimus, depresiją, vaisingumo problemas, mažesnį protinį budrumą, sulėtėjusį vaikų augimą ir daugelį kitų sveikatos problemų.

Kiekviena iš nepakeičiamų aminorūgščių organizme atlieka skirtingą vaidmenį, o trūkumo simptomai atitinkamai skiriasi.

Yra daug nepakeičiamų aminorūgščių rūšių, įskaitant:

Lizinas

Lizinas vaidina svarbų vaidmenį kuriant raumenis, palaikant kaulų stiprumą, padedant atsigauti po traumų ar operacijų, reguliuojant hormonus, antikūnus ir fermentus. Jis taip pat gali turėti antivirusinį poveikį.

Lizino trūkumo tyrimų nėra daug, tačiau tyrimas su žiurkėmis rodo, kad lizino trūkumas gali sukelti streso sukeltą nerimą.

Histidinas

Daug baltymų turinčiuose maisto produktuose, tokiuose kaip tofu ir kvinoja, yra amino rūgščių.

Histidinas palengvina augimą, kraujo ląstelių susidarymą ir audinių atstatymą. Tai taip pat padeda išlaikyti specialią apsauginę nervų ląstelių dangą, vadinamą mielino apvalkalu.

Kūnas metabolizuoja histidiną į histaminą, kuris yra labai svarbus imunitetui, reprodukcinei sveikatai ir virškinimui. Tyrimo, kuriame dalyvavo moterys, turinčios nutukimą ir metabolinį sindromą, rezultatai rodo, kad histidino papildai gali sumažinti KMI ir atsparumą insulinui.

Trūkumas gali sukelti anemiją, o žemas kraujo lygis dažniau pasitaiko žmonėms, sergantiems artritu ir inkstų ligomis.

Treoninas

Treoninas yra būtinas sveikai odai ir dantims, nes yra dantų emalio, kolageno ir elastino komponentas. Tai padeda riebalų apykaitai ir gali būti naudinga žmonėms, sergantiems virškinimo sutrikimu, nerimu ir lengva depresija.

2018 m. Atliktas tyrimas parodė, kad treonino trūkumas žuvyse lėmė, kad šie gyvūnai sumažino atsparumą ligoms.

Metioninas

Metioninas ir neesminė amino rūgštis cisteinas vaidina svarbų vaidmenį odos ir plaukų sveikatai ir lankstumui. Metioninas taip pat padeda išlaikyti stiprius nagus. Tai padeda tinkamai įsisavinti seleną ir cinką bei pašalinti sunkiuosius metalus, tokius kaip švinas ir gyvsidabris.

Valine

Valinas yra būtinas psichiniam susikaupimui, raumenų koordinacijai ir emocinei ramybei. Žmonės gali naudoti valino papildus raumenų augimui, audinių atstatymui ir energijai.

Trūkumas gali sukelti nemigą ir susilpninti psichinę funkciją.

Izoleucinas

Izoleucinas padeda gydyti žaizdas, imunitetą, reguliuoja cukraus kiekį kraujyje ir gamina hormonus. Jis visų pirma yra raumenų audinyje ir reguliuoja energijos lygį.

Vyresni suaugusieji gali būti labiau linkę į izoleucino trūkumą nei jaunesni žmonės. Šis trūkumas gali sukelti raumenų išsekimą ir drebėjimą.

Leucinas

Leucinas padeda reguliuoti cukraus kiekį kraujyje ir padeda augti bei atstatyti raumenis ir kaulus. Tai taip pat būtina žaizdų gijimui ir augimo hormono gamybai.

Leucino trūkumas gali sukelti odos bėrimus, plaukų slinkimą ir nuovargį.

Fenilalaninas

Kai kuriuose dietiniuose gazuotuose gėrimuose yra saldiklių su fenilalaninu.

Fenilalaninas padeda organizmui panaudoti kitas amino rūgštis, taip pat baltymus ir fermentus. Kūnas fenilalaniną paverčia tirozinu, kuris yra būtinas specifinėms smegenų funkcijoms.

Fenilalanino trūkumas, nors ir retas, gali sukelti mažą kūdikių svorio padidėjimą. Tai taip pat gali sukelti egzemą, nuovargį ir atminties problemas suaugusiems.

Fenilalaninas dažnai yra dirbtiniame saldiklyje aspartame, kurį gamintojai naudoja dietiniams sodoms gaminti. Didelės aspartamo dozės gali padidinti fenilalanino kiekį smegenyse, sukelti nerimą ir nervingumą bei turėti įtakos miegui.

Žmonės, turintys retą genetinį sutrikimą, vadinamą fenilketonurija (PKU), negali metabolizuoti fenilalanino. Todėl jie turėtų vengti valgyti maisto produktų, kuriuose yra daug šios amino rūgšties.

Triptofanas

Triptofanas yra būtinas tinkamam kūdikių augimui ir yra serotonino ir melatonino pirmtakas. Serotoninas yra neuromediatorius, reguliuojantis apetitą, miegą, nuotaiką ir skausmą. Melatoninas taip pat reguliuoja miegą.

Triptofanas yra raminantis ir kai kurių miego pagalbinių medžiagų ingredientas. Vienas tyrimas rodo, kad triptofano papildai gali pagerinti sveikų moterų psichinę energiją ir emocinį apdorojimą.

Triptofano trūkumas gali sukelti būklę, vadinamą pellagra, kuri gali sukelti demenciją, odos bėrimus ir virškinimo problemas.

Daugelis tyrimų rodo, kad mažas baltymų ir nepakeičiamų aminorūgščių kiekis veikia raumenų jėgą ir pratimų atlikimą.

Remiantis 2014 m. Atliktu tyrimu, vyresnio amžiaus žmonėms, negavusiems pakankamai būtinų amino rūgščių, gali sumažėti raumenų masė.

Papildomas tyrimas rodo, kad amino rūgščių papildai gali padėti sportininkams atsigauti po treniruotės.

Anksčiau gydytojai manė, kad žmonės turi valgyti maistą, kuriame yra visos devynios nepakeičiamos amino rūgštys.

Dėl to, nebent individas valgydavo mėsą, kiaušinius, pieno produktus, tofu ar kitą maistą su visomis nepakeičiamomis aminorūgštimis, reikėdavo derinti du ar daugiau augalinio maisto, kuriame yra visi devyni, pavyzdžiui, ryžiai ir pupelės.

Tačiau šiandien ši rekomendacija yra kitokia. Žmonės, kurie valgo vegetarišką ar veganišką mitybą, visą dieną gali gauti būtinų aminorūgščių iš įvairių augalinių maisto produktų ir nebūtinai turi juos valgyti visus kartu vieno valgio metu.

Nors 11 aminorūgščių yra neesminės, žmonėms jų gali prireikti, jei jos patiria stresą ar serga. Šiais laikais organizmas gali nepajėgti pagaminti pakankamai šių amino rūgščių, kad atitiktų padidėjusią paklausą. Šios amino rūgštys yra „sąlyginės“, o tai reiškia, kad tam tikrose situacijose žmogus gali jų reikalauti.

Žmonės kartais gali norėti vartoti būtinų amino rūgščių papildų. Geriausia pirmiausia pasitarti su gydytoju dėl saugumo ir dozavimo.

Nors esminių amino rūgščių gali trūkti, dauguma žmonių jų gali gauti pakankamai valgydami dietą, kurioje yra baltymų.

Šiame sąraše esantys maisto produktai yra labiausiai paplitę būtinų amino rūgščių šaltiniai:

  • Lizino yra mėsoje, kiaušiniuose, sojoje, juodosiose pupelėse, quinoa ir moliūgų sėklose.
  • Mėsoje, žuvyje, paukštienoje, riešutuose, sėklose ir visuose grūduose yra daug histidino.
  • Varškėje ir kviečių gemaluose yra daug treonino.
  • Metionino yra kiaušiniuose, grūduose, riešutuose ir sėklose.
  • Valino yra sojoje, sūryje, žemės riešutuose, grybuose, visuose grūduose ir daržovėse.
  • Izoleucino gausu mėsoje, žuvyje, paukštienoje, kiaušiniuose, sūryje, lęšiuose, riešutuose ir sėklose.
  • Pieno produktai, soja, pupelės ir ankštiniai augalai yra leucino šaltiniai.
  • Fenilalanino yra piene, mėsoje, paukštienoje, sojoje, žuvyje, pupelėse ir riešutuose.
  • Triptofanas yra daugumoje baltymų turinčių maisto produktų, įskaitant kviečių gemalus, varškę, vištieną ir kalakutieną.

Tai tik keletas maisto produktų, kuriuose gausu nepakeičiamų amino rūgščių, pavyzdžių. Visuose maisto produktuose, kuriuose yra baltymų, tiek augalinės, tiek gyvūninės, bus bent dalis nepakeičiamų aminorūgščių.

Nepakeičiamų amino rūgščių vartojimas yra labai svarbus sveikatai.

Kiekvieną dieną valgyti įvairų maistą, kuriame yra baltymų, yra geriausias būdas žmonėms užtikrinti, kad jie gauna pakankamą kiekį nepakeičiamų amino rūgščių. Šiuolaikinės dietos ir prieigos prie įvairiausių maisto produktų trūkumas retai pasitaiko žmonėms, kurių sveikata yra gera.


Aminorūgščių katalizuojančio fermento aktyvumo pasekmės T-ląstelių diferenciacijai ir funkcijai

Dauguma aminorūgščių katabolizuojančių fermentų, įskaitant IDO1 ir IL4I1, mažina T-ląstelių proliferaciją ir keičia efektoriaus ir reguliavimo T-ląstelių diferenciacijos pusiausvyrą (4 pav.). CpG stimuliuojamos plazmacitoidinės dendritinės ląstelės sukelia IDO aktyvumą, kuris stabilizuoja Tregs slopinimo fenotipą, tuo pat metu blokuoja IL-6 ekspresiją, reikalingą Th17 ląstelių diferenciacijai (Baban ir kt., 2009). Pelių grybelinės infekcijos metu su Paracoccidioides brasiliensis, IDO1 nebuvimas yra susijęs su padidėjusiu Th17 ląstelių antplūdžiu į užkrėstą plaučius ir kartu sumažėjusiu Th1 ir Treg ląstelių skaičiumi (de Ara újo ir kt., 2017). Įrodyta, kad „Kyns“, kuriuos gamina ir IDO, ir TDO, jungiasi prie arilo angliavandenilių receptorių (AHR)-labai konservuoto ligando aktyvuoto transkripcijos faktoriaus, dalyvaujančio kontroliuojant Trego ir Th17 diferenciacijos pusiausvyrą (Mezrich ir kt., 2010) Opitz ir kt., 2011). Nors tam tikri AHR ligandai skatina Th17 ląstelių diferenciaciją, Kyns aktyvuoja AHR ir sukelia Trego generaciją (Mezrich ir kt., 2010). Be to, triptofano išeikvojimas gali sustiprinti slopinančias Tregs funkcijas, pašalindamas PKC θ iš imuninės sinapsės, taip slopindamas jo signalinį aktyvumą (Zanin-Zhorov ir kt., 2010 Metz ir kt., 2012).

4 pav. Supaprastinta imunosupresinių fermentų įtakos T-ląstelių užpildymui, diferenciacijai ir funkcijai antriniuose limfoidiniuose organuose ir žmonių periferijoje schema. Subrendusios dendritinės ląstelės T-ląstelių zonoje (pvz., Aktyvuotos IFN γ) gali pateikti antigenų, taip pat gaminti citoplazminį IDO ir išskirtą IL4I1. IDO skaido Trp, o IL4I1 - Phe ir, mažesniu mastu, Trp. Šių dviejų nepakeičiamų aminorūgščių lygis mažėja T-ląstelių mikroaplinkoje, tuo tarpu Kyn, fenilpiruvatas (PP), IAA (indolio-3 acto rūgštis), H2O2ir NH3 kaupti. Bendras poveikis riboja na ïve T ląstelių aktyvavimą arba, CD4 T ląstelių atveju, skatina jų diferenciaciją į reguliuojančias T ląsteles. Padidindamas aktyvacijos slenkstį, IL4I1 taip pat gali apriboti pradėtų CD8 T ląstelių repertuarą į didelio afiniteto klonus. Uždegusiuose audiniuose taip pat gali būti išreikšti Arg katabolizuojantys fermentai, taip sumažinant turimo Arg (Arg1) koncentraciją ir gaminant NO (iNOS) ir peroksinitritą. Peroksinitritas (ONOO –) susidaro reaguojant NO su O2 –, kurį gamina „iNOS“ esant žemo Arg lygio sąlygoms. Bendras aminorūgščių bado ir įvairių katabolitų, kuriuos gamina Trp, Phe ir Arg katalizuojantys fermentai, poveikis sumažina efektorinių CD4 ir CD8 T ląstelių įdarbinimą, proliferaciją ir funkciją bei padidina reguliuojančių T ląstelių funkciją. . Apskritai tai sumažina vietinį T-ląstelių atsaką. Fermentinės reakcijos rodomos rodyklėmis. Kataboliniai produktai, neturintys jokio specifinio poveikio T-ląstelių aktyvacijai, yra šviesiai pilki. Kai kurie iš šių produktų naudojami aminorūgščių regeneracijai (argininas iš citrulino, prolinas iš ornitino) arba poliaminų gamybai (ornitinas), kurie yra ląstelių augimo pagrindas.

Na ïve CD4 + T ląstelių diferenciacija, esant IL4I1, taip pat pakreipia jų poliarizaciją link Tregs, tuo tarpu tai iš esmės neturi įtakos Th17 diferenciacijai. This effect appears to involve diminution of mTORC1 signaling (Cousin et al., 2015). However, it has also been recently observed that IL4I1 degradation of tryptophan [a minor substrate in comparison to phenylalanine (Boulland et al., 2007)] produces indole derivatives that can activate the AHR pathway (Sadik et al., 2020 Zhang et al., 2020). Finally, IL4I1 modulates the priming of CD8 + T cells. Indeed, the absence of IL4I1 lowered the activation threshold of cognate CD8 + T cells in a mouse model of acute infection with the lymphocytic choriomeningitis virus, leading to extension of the responding repertoire to low-affinity clones and increased memory T-cell differentiation. Thus, IL4I1 may represent a mechanism to restrain T-cell activation to high-affinity CD8 + T-cell clones (Puiffe et al., 2020).

Arg1 produced by MDSCs has also been suggested to play a role in Th17 differentiation. Indeed, RORγT and IL-17A expression decrease in T cells cultured with MDSCs treated with the Arg1 inhibitor Nor-NOHA (Wu et al., 2016). Consistent with this observation, mice with a conditional deletion of Arg1 in myeloid cells show decreased expression of IL-17A in the colorectum during experimentally induced colitis (Ma et al., 2020). High concentrations of NO provided by the NO donor NOC-18 can suppress the proliferation and function of polarized murine and human Th17 cells by inhibiting the expression of AHR (Niedbala et al., 2011). In accordance with this result, iNOS-deficient mice exhibit enhanced Th17 cell differentiation but no changes in Th1 or Th2 polarization (Yang et al., 2013). Conversely, the use of NOC-18 induces the proliferation and sustained survival of CD4 + CD25 – T cells, which acquire the expression of CD25 but not Foxp3 and present regulatory functions (Niedbala et al., 2007). In sharp contrast with these findings, physiological NO levels produced by the MDSCs of cancer patients or endogenously by CD4 + T cells expressing iNOS can induce and stabilize the Th17 phenotype (Obermajer et al., 2013). Mouse γδ T cells also express iNOS, in particular following stimulation by inflammatory cytokines (Douguet et al., 2018). The enzyme is essential for promoting optimal IL-2 production and proliferation of γδ T cells, but drives IL-17 production, which is associated with pro-tumor properties in a murine model of melanoma (Douguet et al., 2016a,b). These findings illustrate the dual role of NO on T cell activation at the level of T-cell differentiation, depending on its concentration.


What do amino acids do?

Build, repair, regulate, energise

Amino acids are commonly known for their role in muscle protein synthesis. However, the benefits stretch beyond your workout and muscles.

Amino acids make proteins, which make up about 20% of our bodies. Our skin, hair, muscles, internal organs, red and white blood cells all depend on proteins for structure and function. Amino acids also help regulate and maintain most bodily processes by becoming proteins, enzymes or hormones, and by supplying energy to our cells.

Cognitive function & nervous system

The central nervous system controls most bodily functions and our minds. It consists of two parts: the brain and the spinal cord. To function adequately, the brain and central nervous system need a number of amino acids, including histidine, tryptophan, tyrosine, and arginine. The brain uses these to produce various neurotransmitters and neuromodulators.

Hormone production

Simply put, hormones are signalling molecules and they encourage the body to respond to stimuli. Hormones raise our blood pressure during exercise, allow us to sweat when we're hot and more. Amino acids can either be used as building blocks for specific hormones or to encourage the release of hormones.

There is evidence that the amino acids lysine and arginine help to trigger the release of growth hormones, encouraging the growth and development of cells, which can be particularly useful for children and sports people looking to gain muscle mass.

Digestive system

Amino acids are the major fuel of the small intestine membrane and they are also used to support the intestinal immune and anti-oxidative responses. Glutamate, glutamine and aspartate, in particular, are vital. You may have heard the phrase that your gut is your first line of defence against disease and pathogens and amino acids play a major role in these defenses.

Reproductive system

The availability and metabolism of amino acids, which interact with other macronutrients, is vital for various reproductive processes, including gametogenesis, fertilisation, implantation, placentation, foetal growth and development.

Immune system

The immune system protects your body from outside invaders, such as bacteria, viruses, fungi, and toxins. The system is made up of different organs, cells and proteins that work together.

A deficiency of dietary protein or amino acids impairs immune function and increases susceptibility to infectious disease. That’s because protein is broken down to provide amino acids for the creation of new cells, proteins and peptides, vital for the immune response. Amino acids can be used as fuel by the immune system either directly, or following their conversion to other amino acids (e.g., glutamine) or to glucose for energy.

Mounting evidence shows that giving specific amino acid supplements to animals and humans with malnutrition and infectious disease improves the immune response. Arginine, glutamine and cysteine precursors are the best used examples in recent studies.


Materials and methods

Contact for reagent and resource sharing

Further information and requests for resources and reagents should be directed to and will be fulfilled by Kenneth Dyar ([email protected]).

Ethics statement

All experimental procedures were performed according to European Commission guidelines and were reviewed and approved by the local Veterinary Central Service, University of Padova, and the relevant Italian authority (Ministero della Salute, Ufficio VI), in compliance with Italian Animal Welfare Law (Law n 116/1992 and subsequent modifications) and Directive 2010/63/EU of the European Parliament. Accordingly, experiments performed before 2012 were sent to the Italian Ministry of Health (Project# 27/09). Experiments performed after 2012 were approved by the Italian Ministry of Health (Decree# 164/2012-B of 09.08.12).

Animals

Animals were housed in a temperature-controlled room (22 °C) under a 12-hr light/dark regimen, with lights on at ZT0 (6 AM) and lights off at ZT12 (6 PM), with standard chow diet (Mucedola, Settimo Milanese, Italy) and water provided ad libitum. Muscle-specific inactivation of Bmal1 (mKO) was obtained as described [7] by crossing a floxed Bmal1 C57BL/6 mouse line with a C57BL/6 mouse line carrying a Cre recombinase transgene under control of the Mlc1f promoter (Mlc1f-Cre). In the resulting mKO mice, the region coding for the BMAL1 bHLH DNA binding domain is excised. Cre-negative littermates were used as controls. All mice used in this study were 3–5-mo-old male littermates, unless specified otherwise. Littermates were randomly assigned to experimental groups. Tissues were collected immediately after cervical dislocation at ZT0, 4, 8, 12, 16, and 20, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at −80 °C until subsequent use. S4 Table details the various muscles and tissues used for this paper.

Metabolic phenotyping

Total body fat and lean tissue mass were quantified by nuclear magnetic resonance (EchoMRI). EE, RER (VCO2/VO2), locomotor activity, and feeding behavior were monitored on a TSE system (Bad Homburg, Germany).

Exercise and endurance training experiments

To measure exercise endurance, forced running on a motorized treadmill was used (Harvard Apparatus PANLAB, LE 8710 M). The protocol was based on [135], with some minor modifications. Briefly, mice were first acclimated to low-speed running (22 cm/s and 10% incline) for 10 min each day for 2 d prior to the test. Acclimation was always performed under dim red light around ZT12 (lights off), the normal start of the circadian activity phase. On the day of the endurance test, food was removed 3 hr before starting at ZT12 to ensure consistent baseline blood glucose levels. For the test, mice began running at 22 cm/s and 10% incline under dim red light. Speed was gradually increased by 5 cm/s every 30 min up to 45 cm/s. Mice were encouraged to run by humanely stimulating their tail with a soft brush. The operator was blind to genotype of the mice, and exhaustion was defined by mice refusing to run for 10 sec and confirmed by blood glucose <76 g/dl [75]. Time and running distance were recorded for each mouse. For endurance training, mice trotted on a motorized treadmill 25 cm/s and 0% incline 1 hr daily for 4 wk, starting around ZT12. After humanely encouraging mice to run with a soft brush on their tail during the first few acclimation sessions, mice ran without much need for further encouragement.

Clinical blood chemistry

Sedentary mice were either fed ad libitum, and blood was collected at ZT14 (“fed ZT14”), or fasted for 4 hr late in the afternoon (ZT7–ZT11), and blood was collected at ZT11 (“fasted ZT11”). A separate cohort of endurance-trained WT and mKO littermates was measured after 4 wk training on a motorized treadmill 25 cm/s and 0% incline 1 hr daily, starting around ZT12. Blood was collected after running 25 cm/s and 0% incline for 1 hr. Blood was collected from the orbital sinus in heparin-coated Pasteur pipettes and centrifuged immediately after collection. Plasma samples were kept at −20 °C until dosing. FFAs, β-OH-B, and AcAc were dosed using an automated spectrophotometer, Cobas Fara II (Roche), according to the manufacturer’s instructions. Blood glucose and lactate levels were measured with a YSI 2300 STAT Plus glucose and lactate analyzer (YSI Life Sciences, Yellow Springs, OH) according to the manufacturer’s instructions.

Quantification of serum amino acids

Mice were fasted 6 hr (8 AM–2 PM), and blood was collected at ZT8 (2 PM). Blood was collected from the orbital sinus in Pasteur pipettes, allowed to clot at room temperature (RT) for 30 min, centrifuged, and kept at −20 °C until use. Amino acid concentrations were assessed by GC/MS (HP 5890 Agilent Technologies, Santa Clara, CA), using the internal standard technique, as previously reported [136]. Briefly, known amounts of internal standards (L-[ 15 N]glycine, L-[ 15 N]glutamate, L-[ 15 N]glutamine, L-[1- 13 C, methyl- 2 H3]methionine, L-[3,3- 2 H2]cysteine, L-[ 15 N]alanine, L-[1- 13 C]leucine, L-[1- 13 C]phenylalanine, L-[3,3- 2 H2]tyrosine, L-[ 15 N]threonine, L-[ 15 N]serine, and L-[ 15 N]proline [Cambridge Isotope Laboratories]) were added to plasma samples. Amino acid concentrations were determined considering the following mass-to-charge ratios (m/z): 218/219 for glycine, 432/433 for glutamate, 431/432 for glutamine, 320/324 for methionine, 406/408 for cysteine, 158/159 for alanine, 302/303 for leucine, 336/337 for phenylalanine, 466/468 for tyrosine, 404/405 for threonine, 362/363 for serine, and 184/185 for proline.

In vivo ChIP assays

In vivo skeletal muscle ChIP was performed with sonicated nuclear extract prepared from formaldehyde-cross-linked gastrocnemius muscle according to [137]. For immunoprecipitation, we used anti-BMAL1 (ab93806, Abcam), anti-REV-ERBα (generous gift from Ron Evans), anti-RNA Polymerase II (#MMS-126R clone 8WG1, Biolegends), anti-NCOR1 (#20018-1-AP, Protein Tech), anti-HDAC3 (ab7030, Abcam), or rabbit IgG (2027x, Santa Cruz). DNA was column purified and used for sequencing or real-time qPCR (enrichment expressed as fold-change relative to IgG primer sequences used are listed in S4 Table).

ChIP-seq library prep

Libraries from ChIP and input DNA were prepared with the KAPA Hyperprep Kit (Kapa Biosystems, KK8504) Illumina-compatible adapters were synthesized by Integrated DNA Technologies (IDT) and used at a final concentration of 68 nM. Adapter-ligated libraries were size selected (360–610 bp) in a Pippin Gel station (Sage Science) using 2% dye free gels (Sage Science, CDF2010). Library concentration was estimated by real-time PCR with the KAPA Library Quantification Kit (Kapa Biosystems, KK4873). Library quality was evaluated with the Agilent High Sensitivity DNA Kit on a 2100 Bioanalyzer (Agilent). Libraries were run on a HighSeq2500/HighSeq4000 sequencers (Illumina) at the NGS Core Facility at HMGU.

Bioinformatics pipeline for ChIP-Seq data analysis

Pre-processing.

ChIP-Seq FASTQ files were mapped against the mouse mm10 genome with BWA version 7.12 using MEM algorithm [138]. Duplicate reads were removed using samtools version 0.1.19 [139]. Multi-mapping reads were removed with bamtools version 2.4.0 [140] using read threshold of MAPQ ≥ 24.

Adjusting sequencing depth.

Sequencing read depth was adjusted by down sampling replicate BAM files to the replicate with lowest read count, resulting in about 13 million unique reads for RNAP2 and about 20 million unique reads each for BMAL1 and REV-ERBα replicates (see Table 1 below for further details).

Peak calling.

Macs2 version 2.1.1 [141] peak caller was used to perform peak calling on the replicates using input DNA. Peak calling cutoff was set to p-value 0.05. In addition to narrow peak files, read density distribution (Bedgraphs) was used to visualize ChIP-seq tracks using Integrated Genome Browser [142].

Peak universe, “high confidence” and “confident” peak tables, and overlapping peaks.

A peak table was created for each sample. Replicate sample tables were then combined into a unified peak universe for each factor with unique ranges across the genome and containing overlapping peaks information including the tag counts (enrichment score). “High confidence” peaks were identified as reproducible peaks common between replicate samples. “Confident” peaks were reproducible peaks common between BMAL1 and REV-ERBα and present in ≥3 of the 4 samples.

To assess overlapping peaks between liver and muscle, liver peak location coordinates for BMAL1 [14] and REV-ERBα [15] were first converted from mm9 to mm10 using UCSC liftOver.

Heatmaps.

Bedgraphs were used to plot the read density map near the universe peak centers using deepTools version 2.2.4 [143]. Replicates for each factor were merged using UCSC tools bedGraphToBigWig and bigWigMerge (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/macOSX.x86_64/).

Then, deepTools computeMatrix tool was used followed by plotHeatmap tool [143].

Peak annotation.

Peak annotation was performed with HOMER version v4.8 [144]. GENCODE database for mm10 [145] was used as a reference for assigning feature level annotation.

Motif discovery.

To minimize bias, a combination of two different methods was used for motif discovery:

  1. HOMER version v4.8 [144]. For BMAL1 we searched for motifs of 8-, 10-, 12-, 14-, 15-, and 16-mers. For REV-ERBα, we searched for motifs of 8-, 10-, and 12-mers.
  2. Clover version published on Jan 14, 2016 [146], was used with default settings.

Functional enrichment analysis of peaks.

Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT) [16] was used to analyze functional significance of BMAL1 and REV-ERBα peaks using mouse NCBI build 38 genome assembly (mm10), whole genome as background, and associating genomic regions with genes using “basal plus extension” and the following parameters: proximal 20 kb upstream, 2 kb downstream, plus distal up to 500 kb.

Global metabolite profiling

Metabolite profiling, peak identification, and curation were performed by Metabolon using described methods [147]. Briefly, the nontargeted metabolic profiling platform used by Metabolon combines 3 independent platforms: UHPLC/MS/MS optimized for basic species, UHPLC/MS/MS optimized for acidic species, and GC/MS. We analyzed a total of 60 TA muscles from 60 male muscle-specific Bmal1 KO and control littermates (5 × group × time point).

Metabolomics data processing and analysis

Metabolomics data (“origscale”) can be found in supporting file S3 Data. The data were first normalized according to raw area counts and processed according to [148]. Run day correction was performed for each metabolite by setting the run day medians equal to 1. We removed metabolites with more than 50% missing values and transformed data to log10. Data points outside 4 times the standard deviation for each metabolite were considered as outliers and removed. Missing data were imputed by k-nearest-neighbor algorithm. To identify metabolites that show significant change over time and/or genotype, we fit data to a linear mixed effects model. Significant changes were estimated by performing F-test statistics to each fixed effect term (ANOVA) Genotype, Time, Genotype × Time. Calculations were done using MATLAB R2015b, Statistics Toolbox. Heatmaps were generated using the mean of 5 replicates. Hierarchical clustering was performed with squared euclidean distance and Ward’s minimum variance algorithm. Data were sorted by phase according to WT muscle and aligned between groups to show effect in mKO. Metabolites were categorized according to Metabolon superpathways: Amino Acids, Carbohydrates, Cofactors and Vitamins, Energy, Lipids, Nucleotides, Peptides, and Xenobiotics. To identify significantly enriched KEGG pathways in our data, we performed a hypergeometric distribution test on metabolites showing a Genotype effect p < 0.05. To identify 24-hr cycling metabolites, we used the nonparametric test JTK_CYCLE as described in [147], using an adjusted p < 0.05.

Extraction of total lipids

Muscles were weighed and homogenized in 800 μl dH2O. Lipids were extracted twice according to Folch and colleagues [149] using chloroform/methanol/water (2/1/0.6, v/v/v) containing 500 pmol butylated hydroxytoluene, 1% acetic acid, and 100 pmol of internal standards (ISTD, 17:0–17:0 PC, 17:0 LPC, 17:0–17:0–17:0 TG, Avanti Polar Lipids) per sample. Extraction was performed under constant shaking for 90 min at RT. After centrifugation at 1,000 x g for 15 min at RT, the lower organic phase was collected. Then, 2.5 ml chloroform was added to the remaining aqueous phase, and the second extraction was performed as described above. Combined organic phases of the double extraction were dried under a stream of nitrogen and resolved in 900 μl 2-propanol/chloroform/methanol (7/2/1, v/v/v).

Quantitative analysis of TG by HPLC with light scattering detection

For HPLC-ELSD, 20 μl of the resolved extract was evaporated and dissolved in 100 μl chloroform/methanol (2/1, v,v). The chromatographic setup for lipid separation consisted of an Agilent 1100 combining pump, injector, precooled sample manager (4 °C), and column oven (40 °C) (Agilent, Santa Clara, CA). For detection of lipids, a Sedex 85 evaporative light scattering detector (Sedere, Alfortville, France) was used. Data acquisition was performed by the Chemstation software (B 04.01, Agilent, Santa Clara, CA). A ternary gradient with a Betasil Diol column (100 × 4.6 mm, particle size 5 μm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) was used for chromatographic separation. The solvent system consisted of eluent A (isooctane/ethylacetate, 99.8/0.2, v/v), eluent B (acetone/ethylacetate, 2/1, v/v, containing 0.02% [v/v] acetic acid), and eluent C (isopropanol/water, 85/15, v/v, containing 0.05% [v/v] acetic acid and 0.3% [v/v] ammonium acetate). For external calibration, TG 54:3 (Larodan, Solna, Sweden) was prepared in chloroform:methanol (2:1, v/v), and the final concentration ranged from 1 μM to 2.5 μM. Injection volume for all samples including external calibration was 10 μl.

Qualitative analysis of lipids by ultra-performance liquid chromatography (UPLC) with qTOF detection

For UPLC-qTOF, 120 μl of the resolved extract was transferred to an autosampler vial for analysis. Chromatographic separation was performed using an AQUITY UPLC system (Waters), equipped with a BEH-C18-column (2.1 × 150 mm, 1.7 μm Waters) as previously described [150]. A SYNAPTG1 qTOF HD mass spectrometer (Waters) equipped with an ESI source was used for detection. For positive and negative ionization mode, 5 μl and 10 μl were injected, respectively. Data acquisition was done by the MassLynx 4.1 software (Waters Corporation). Lipid classes were analyzed with the “Lipid Data Analyzer 1.6.2” software [151]. Extraction efficacy and lipid recovery were normalized using ISTD, and lipid classes were expressed as percent composition.

Separation of neutral lipids by thin-layer chromatography

Extracted lipids were spotted on a silica gel 60 (Merck, Darmstadt, Germany). For comparison, a standard solution containing TG 54:3 was used. The silica gel was developed using n-hexane/diethylether/acetic acid (80/20/2, v/v/v) as solvent system, and lipids were visualized by charring using concentrated sulfuric acid.

Palmitate oxidation

Gastrocnemius muscles were immediately removed after cervical dislocation. Tissues were quickly weighed, and placed in ice-cold homogenization buffer (250 mM Sucrose, 10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH = 7.4). Muscles were then thoroughly minced with scissors and transferred to a 10 ml glass homogenization mortar on ice, and ice-cold homogenization buffer was added up to a 20-fold dilution (w/v) suspension. Samples were then homogenized with 10 strokes of a motor-driven, tightly fitting glass mortar/Teflon pestle Potter Elvehjem homogenizer operated at 1,600 rpm. Reactions were initiated by adding 50 μl of muscle homogenates to 450 μl of prewarmed oxidation medium (30 °C 111 mM sucrose, 11.1 mM Tris-HCl, 5.56 mM KH2PO4, 1.11 mM MgCl2, 88.9 mM KCl, 0.222 mM EDTA, 1.11 mM DTT, 2.22 mM ATP, 0.33% fatty acid–free BSA, 2.22 mM Carnitine, 0.056 mM CoA, 0.111 mM Malate, 222 uM cold Palmitate, + 0.5 uCi [1- 14 C]-palmitic acid prepared fresh daily pH 7.4). After incubation for 90 min in a shaking water bath (100 rpm 30 °C), reactions were terminated by addition of 100 μl 1 M perchloric acid, and the CO2 produced during the incubation was trapped in 100 μl NaOH that had been added to a small tube inside the reaction vial. Palmitate oxidation rates were determined by measuring incorporation into 14 CO2 and 14 C-acid-soluble metabolites (ASM) by liquid scintillation counting.

Analysis of mitochondrial function

Spectrophotometric activity of mitochondrial respiratory chain complexes CI, CII, CIII, CII+III, CIV, as well as CS, was measured according to [152] using muscle homogenates from frozen vastus lateralis muscles from the same cohort of mice used for gene expression and metabolomics analyses. Mitochondrial membrane potential was measured by epifluorescence microscopy based on the accumulation of TMRM fluorescence in isolated muscle fibers from flexor digitorum brevis (FDB) muscles as previously described [153], with minor modifications. Briefly, fresh FDB muscles from adult mice were digested in type I collagenase at 37 °C for 2 hr and dissociated into single fibers by gentle pipetting. Isolated FDB myofibers were then placed in 1 ml Tyrode’s buffer (Sigma) and loaded with 2.5 nM TMRM (Molecular Probes) supplemented with 1 μM cyclosporine H (a P-glycoprotein inhibitor) for 30 min at 37 °C. At the times indicated by arrows, oligomycin (Olm, 5 μM Sigma) or the protonophore FCCP (4 μM Sigma) was added to the culture medium.

Assessment of muscle protein synthesis

Quantification of muscle protein synthesis rates was performed using the nonradioactive IV-SUnSET technique as described in [78].

Gene expression profiling and analyses

Microarray sample processing, quality control, and data analysis are reported in [7].

SDS-PAGE and western blotting

Muscle lysates were prepared in RIPA buffer (Sigma) supplemented with Halt protease and phosphatase inhibitor cocktail (#78446, Thermo Scientific), protein concentration determined using the bicinchoninic acid assay (Pierce, Rockford, IL, USA), and SDS-PAGE performed using NuPAGE 4%–12% gels (Invitrogen). Proteins were transferred onto a PVDF membrane and incubated with rabbit anti-REV-ERBα (kind gift from Ron Evans), mouse anti-REV-ERBβ (D-8 sc-398252, Santa Cruz), or mouse anti-GAPDH (ab8245, Abcam). Membranes were then incubated with HRP-conjugated donkey anti-rabbit (sc-2317, Santa Cruz) or goat anti-mouse (170–6516, Biorad) secondary antibodies. HRP activity was measured by chemiluminescence (Immobilon Western, Millipore), and bands visualized on CP-BU Medical X-Ray Film (Agfa HealthCare NV, Gevaert, Belgium).

Plasmids

Mouse promoter regions of Rev-erbα (forward, 5′-CCCCTAGTCACCACTAACCTC-3′ reverse, 5′-AGAGACGTGTGCCCTGCTA-3′), Rev-erbβ (forward, 5′-ATGTAGGAGGGAGGCTCGG-3′ reverse, 5′-GCCTCGCGCAGACTATGG-3′), Dgat2 (forward, 5′-AGCTGCTAGGATTGTAGGATTACAG-3′ reverse, 5′-AGAGCTGAGGTAGGTAGCCG-3′), and Coq10b (forward, 5′-GCTAACCAAATGCAGCAGGC-3′ reverse, 5′-TGTGAAGCCGGTAGCCAAC-3′) were amplified using High Fidelity Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen), cloned into pGL3-Basic (Promega), and verified by sequencing. pRL-CMV renilla expression construct was from Promega. pCMV-AC-mKate (mKate2) was from OriGene. Both mPer2::luc (423-bp mPer2 promoter fragment) and mBmal1::luc (530-bp mBmal1 promoter fragment) reporter plasmids were generous gifts from Kazuhiro Yagita and described in [154]. Mouse full-length Bmal1 ir Clock pcDNA3-HA constructs were generous gifts from Marina Antoch (Roswell Park Cancer Institute) and described in [155]. Mouse full-length Rev-erbα ORF (forward, 5′-ATGACGACCCTGGACTCCAA-3′ reverse, 5′-TCACTGGGCGTCCACCCGGA-3′) was amplified using AccuPrime GC-Rich DNA Polymerase (Invitrogen) and shuttled into Gateway pDONR-221 (Invitrogen) with Gateway BP Clonase Enzyme (Invitrogen). Mouse Rev-erbα ORF was then shuttled into Gateway pcDNA-Dest47 expression vector with Gateway LR Clonase Enzyme (Invitrogen). The −1 kb and −5 kb MuRF-1 promoter luciferase reporters and c.a.FOXO3A plasmids were generous gifts from Marco Sandri. The mouse GR construct was generated by PCR amplifying a Kpn1/BamH1 PCR fragment from full-length mouse GR ORF (BioScience IMAGE40111802) using forward 5′-GGGGTACCATGGACTCCAAAGAATC-3′ and reverse 5′- CGGGATCCTCATTTCTGATGAAAC-3′ primers and cloning into Kpn1/BamH1-digested pcDNA3.

In vitro transfection and luciferase assays

HEK-293T cells were cultured in DMEM with 10% FBS and penicillin-streptomycin. Cells were seeded in 96-well plates at 100,000 cell/mL for transfection and luciferase measurements. For BMAL1 target validation, cells were cotransfected with 25 ng promoter reporter construct, 25 ng pRL-CMV, and either 25 ng BMAL1-HA + 25 ng CLOCK-HA or 50 ng empty pcDNA3. For REV-ERBα sensor validation, cells were cotransfected with 25 ng mBmal1::luc, 25 ng pRL-CMV, and either 200 ng REV-ERBα or 200 ng empty pcDNA-Dest47. For MuRF-1 reporter experiments, cells were cotransfected with 25 ng MuRF-1 reporter, 25 ng pRL-CMV, and 25 ng each of GR, c.a.FOXO3A, and REV-ERBα. To maintain consistent DNA transfection concentrations across experiments, 50 ng or 25 ng empty pcDNA-Dest47 was supplemented, respectively, when transfecting only one or two transcription factors. Transfection was performed with FuGene HD (Promega) and transfection medium replaced with Phenol Red free DMEM. The next day, cells were lysed, and firefly and renilla luciferase were sequentially measured using Dual-Glo Luciferase assay system (Promega). Firefly raw values were normalized to Renilla raw values for each replicate. Data from 2 independent experiments are expressed as mean fold-change of the test condition normalized to the empty vector ± SEM.

In vivo transfection of adult skeletal muscle

Six-mo-old adult male Bmal1 mKO mice and WT littermates were anesthetized by i.p. injection of a mixture of Zoletil 100 (a combination of Zolazapam and Tiletamine, 1:1, 10 mg/kg, Laboratoire Virbac) and Rompun (Xilazine 2%, 0.06 ml/kg, Bayer). Gene transfer of TA muscles was induced by intramuscular injection of plasmid DNA (40 μg, consisting of 15 μg mBmal1::luc reporter plasmid, 5 μg mKate2 exogenous spike-in control, and 20 μg either REV-ERBα or empty pcDNA-Dest47) followed by electroporation using stainless steel electrodes connected to a ECM830 BTX porator (Genetronics, San Diego, CA).

Optical bioluminescence imaging

In vivo bioluminescence images were acquired with the IVIS 100 system (Perkin-Elmer) under general anesthesia by i.p. injection of a mixture of Zoletil 100 (a combination of Zolazapam and Tiletamine, 1:1, 10 mg/kg, Laboratoire Virbac) and Rompun (Xilazine 2%, 0.06 ml/kg, Bayer) and analysis performed according to [156] with the following parameters: field of view 25 cm, binning factor 8, exposure time 1 min. Living Image software (version 4.3) was used for image capture and analysis.

RNA isolation and qPCR

Total RNA was isolated, purified, and reverse transcribed to cDNA, and RT-qPCR was performed as described in [7]. Analysis was performed using the standard curve method, and all data were normalized relative to 36B4 expression.

Quantification and statistical analysis

All data are expressed as means ± SEM unless otherwise stated. Statistical analysis was performed using unpaired Student’s t test or 2-way ANOVA. When ANOVA revealed significant genotype differences, further analysis was performed using Bonferroni’s multiple comparison test. Differences between groups were considered statistically significant for p < 0.05.